远志HMGR、CHS基因的克隆与表达研究

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目的:克隆远志3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因与查尔酮合成酶(CHS)基因,分析其基因表达量对药用成分含量的影响,并从酶活性的角度验证HMGR的功能,为远志资源的可持续利用及种质改良提供借鉴。方法:(1)通过RT-PCR与RACE相结合的方法克隆远志HMGR、CHS基因的全长序列,并对其进行生物信息学分析,同时对HMGR、CHS基因编码的蛋白功能与结构进行预测与分析。(2)利用RT-qPCR技术、紫外分光光度法、高效液相色谱法分别测定了远志根、茎、叶不同部位HMGR基因及CHS基因表达量、远志总皂苷及总黄酮含量、细叶远志皂苷及远志口山酮Ⅲ含量,并对基因表达量与药用成分进行相关分析。(3)通过气相色谱质谱联用法对HMGR的功能进行验证。结果:(1)从远志中克隆获得HMGR、CHS基因的全序列,并分别命名为PtHMGR、PtCHS,(GenBank登录号分别为MK424118、MK424117)。PtHMGR cDNA序列为全长2323 bp,包含一个1782 bp的完整开放阅读框,共编码593个氨基酸;预测PtHMGR编码蛋白的理化性质,其分子式为C2781H4486N770O853S33,分子量为63414.84 Da,等电点PI为6.09。PtCHS cDNA序列为全长1634 bp,包含一个537 bp的完整开放阅读框,共编码178个氨基酸;预测PtCHS编码蛋白的理化性质,其分子式为C895H1420N244O251S12,分子量为19999.33 Da,等电点PI为9.25。(2)远志PtHMGR、PtCHS基因在根、茎、叶不同部位之间差异表达,其中PtHMGR基因在根部表达量最高,叶次之,茎部表达较低;PtCHS基因在茎部表达量最高,叶次之,根部最少。远志根、茎、叶不同部位总皂苷、总黄酮、细叶远志皂苷、远志口山酮Ⅲ的含量也存在差异,其中总皂苷、细叶远志皂苷、远志口山酮Ⅲ在根部含量较高,而总黄酮主要积累于茎部。远志PtHMGR、PtCHS基因表达量与药用成分相关分析显示,总皂苷及细叶远志皂苷含量与PtHMGR基因的表达呈正相关;总黄酮含量与PtCHS基因表达呈正相关,而远志口山酮Ⅲ含量与PtCHS基因表达量呈负相关。(3)HMGR经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后成功表达,并催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龙酸内酯。结论:本研究首次从远志中克隆获得HMGR、CHS基因的全序列,并分析了远志PtHMGR、PtCHS基因与药用成分的关联性,结果显示总皂苷及细叶远志皂苷含量与PtHMGR基因的表达量正相关;总黄酮含量与PtCHS基因表量正相关。利用气相色谱质谱联用法对PtHMGR的功能进行验证,结果显示,远志PtHMGR具有HMGR酶的催化功能,可催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龙酸内酯。因此可通过上调基因的表达来促进远志药效成分的积累,进而提高远志药材的质量。
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