心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)患者最常见的并发症和首位死亡原因。随着透析技术的提高,尿毒症患者的生存时间得以延长,但与此同时心脏暴露于尿毒症状态的时间也相应延长。因此明确尿毒症状态下CVD的发病机制及干预措施已成为当前肾病领域需要重点关注的问题。心肌肥厚是CKD患者最常见的心脏病理改变,也是心衰及心脏猝死发生的重要原因,但其具体发病机制目前还不清楚。既往的研究认为高血压、贫血、高容量负荷等因素与CKD状态下左室肥厚(Left ventricular hypertrophy,LVH)的发病有关。但是,越来越多的研究发现,上述传统危险因素不足以解释CKD状态下LVH的高发病率,有学者认为尿毒症毒素可能是CKD患者CVD高发病率的重要原因。因此,从分子或细胞水平探讨尿毒素心血管损害的具体机制,并以此为基础寻找有效干预措施将具有非常重要的意义。硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)是一种小分子尿毒症毒素,正常人体内含量低于0.1-2.39μM,但由于其亲蛋白特性,传统透析很难将其清除,随着CKD患者病情进展,血清IS水平甚至可高达500μM以上。研究表明,IS在肾脏纤维化、血管平滑肌细胞增殖及内皮功能紊乱中均发挥重要作用,而且CKD患者血清IS水平与其CVD的发病率及死亡风险呈正相关。另外,有报道证实LVH主要发生于CKD的3,4期并随CKD的恶化而加重,而IS恰好也在CKD3期开始升高,这就提示IS可能与CKD患者LVH的发生相关。此外,新近多项研究及我们课题组的研究发现IS可以通过促进氧化应激诱导心肌细胞肥大,但是,IS促进氧化应激和诱导心肌细胞肥大的具体机制仍不明确。解偶联蛋白(Uncoupling protein,UCP)是一类位于线粒体内膜上的质子转运蛋白,可通过改变线粒体内膜两侧质子梯度参与能量代谢过程。目前已发现5种UCPs同系物,其中UCP2广泛表达于哺乳动物心、肾、肝等多种组织器官,可通过降低线粒体内膜两侧的跨膜质子梯度减少三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的合成。此外,UCP2还参与细胞活性氧(Reactive oxidative species,ROS)生成、胰岛素分泌等多种生理过程。既往研究提示ucp2可以通过抑制氧化应激,调节胞内钙离子浓度等途径减少心肌细胞凋亡、保护血管内皮、防止动脉硬化斑块形成。基于目前已有的研究进展,人们发现ucp2主要在能量代谢异常和对抗氧自由基损伤方面发挥着重要作用,然而这类结果主要源于糖尿病、维生素d缺乏症等代谢性疾病的研究,ucp2在尿毒素诱导的氧化应激和心肌肥大中的作用及机制国内外尚无文献报道。所以,我们拟在前期研究基础上进一步明确ucp2是否在is促进氧化应激和诱导心肌细胞肥大过程中发挥了重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(ampactivatedproteinkinase,ampk)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛表达于人体各组织,在心脏尤为丰富。既往的研究表明,ampk激活后可以上调ucp2,减少能量消耗,对抗氧化应激,发挥积极的心血管保护作用。最近多项研究发现,ampk激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸转甲酰酶(amino-imidazolecarboxamideribonucleotide,aicar)及二甲双胍等可以通过激活ampk抑制心肌细胞肥大。因此,ampk调控ucp2的这种上下游关系是否参与了is诱导的心肌细胞肥大亦成为本课题研究的一个关键内容。为此,本研究以体外培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象,以is为主要处理因素,通过慢病毒转染、免疫荧光组织化学染色、westernblot、核素示踪、realtimepcr等多种技术,对ucp2在is诱导心肌细胞肥大中的作用及其机制进行了探讨。我们的研究分为以下三个部分:(1)观察is对大鼠心肌细胞ros生成及细胞肥大的影响;(2)观察is对心肌细胞ucp2表达的影响,并通过制备ucp2慢病毒颗粒,转染心肌细胞,观察ucp2过表达对is诱导心肌细胞ros生成的影响;(3)通过激活/抑制ampk的活性,明确ampk调控ucp2在is诱导ros产生及促进心肌细胞肥大中的作用。最终阐明ucp2在is诱导心肌细胞肥大中的作用和分子机制。主要研究结果及结论如下:一、is促进ros过量生成并诱导心肌细胞肥大:与对照组相比,is处理组心肌细胞ros生成明显增多,且存在剂量依赖性;另外,我们发现500μmis处理48h后,心肌细胞的体积、蛋白合成速率及心房利钠肽(atrialnatriureticfactor,anf)、脑钠肽(brainnatriureticpeptide,bnp)、β-肌球蛋白重链(β-myosinheavychain,β-mhc)mrna表达水平较对照组明显增加,提示is可以促进ros过量生成并诱导心肌细胞肥大。二、is可以下调心肌细胞ucp2表达:用500μmis作用心肌细胞,随着作用时间的延长,心肌细胞ucp2蛋白水平逐渐下降。之后再用不同浓度的is作用心肌细胞1h,发现UCP2表达水平亦呈下降趋势,提示IS可以下调心肌细胞内UCP2蛋白表达水平,并呈现时间和剂量依赖性。三、UCP2过表达可以抑制IS诱导的ROS生成:首先用重组UCP2慢病毒颗粒转染心肌细胞,继而观察UCP2过表达对IS诱导心肌细胞ROS生成的影响。我们发现与IS及IS+空载体组相比,IS+UCP2过表达组ROS生成明显减少,提示IS通过下调UCP2表达促进ROS生成,而上调UCP2表达则可以抑制IS诱导的ROS生成。四、AMPK激活可以抑制IS诱导的UCP2下调及ROS生成:我们用500μM IS处理心肌细胞不同时间后发现AMPK磷酸化水平明显下降,同时AMPK激活剂AICAR预孵育可以抑制IS诱导的UCP2下调,提示IS下调UCP2蛋白表达与其抑制AMPK激活有关。另外,与IS组相比,ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)孵育组及AICAR预孵育组ROS生成量明显减少。提示IS可能通过抑制AMPK激活下调UCP2表达,进而导致心肌细胞内ROS过量生成。五、AMPK激活或UCP2过表达可以拮抗IS诱导的心肌细胞肥大:以细胞体积、蛋白合成速率及ANF、BNP、β-MHC mRNA表达水平作为心肌细胞肥大的观察指标,观察AMPK激活及UCP2过表达对IS诱导的心肌细胞肥大的影响。结果发现,与单纯IS处理组相比,UCP2过表达组及AICAR预孵育组心肌细胞体积较小、蛋白合成速率较慢、ANF、BNP、β-MHC的mRNA表达水平较低。提示AMPK激活或UCP2过表达可以拮抗IS诱导的心肌细胞肥大。综上所述,我们的课题研究表明,IS可以通过抑制AMPK激活下调心肌细胞UCP2的表达,从而诱导ROS过量生成,导致心肌细胞肥大的发生,而UCP2过表达或AMPK激活可以明显拮抗IS诱导的心肌细胞肥大。提示IS诱导心肌细胞肥大可能与AMPK/UCP2/ROS信号通路有关。通过我们的研究,不仅进一步证实了尿毒症毒素在CKD患者心肌肥厚中的重要作用,也从一定程度阐明了IS诱导心肌细胞肥大的发生机理,为临床预防及治疗尿毒症心肌病提供了更充足可靠的理论依据。