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癌症是危害人类生命和健康的要杀手,新病例每年都在增加。中国的癌症发病率和死亡率很高,结直肠癌是最严重的癌症之一。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是主要发生在结肠和直肠中的是一种原发性肿瘤。其发病率、死亡率和复发率均较高,是消化道恶性肿瘤之一。近年来,结直肠癌的治疗已经有了很大的改善,但其复发和转移仍然是术后患者死亡的主要原因。它已成为限制患者生存和改善预后的瓶颈。生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP-43)是与神经发育、突出形成等密切相关的磷酸蛋白。目前,有报道GAP-43对脑胶质瘤细胞和乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用,但相关的抑制机制尚不清楚。课题组前期通过对TCGA数据库中结直肠癌的基因组数据分析,发现了GAP-43基因在结直肠癌中存在显著的表达沉默现象,其基因启动子区存在甲基化修饰,但其特异性沉默机制尚不清楚。为了对这一发现进一步确认,本文首先选取结直肠癌患者的临床组织样本进行实时定量PCR(qRT-PCR)实验,结直肠癌组织中GAP-43 mRNA的表达水平显著低于正常癌旁组织。通过免疫组化(IHC)实验,发现GAP-43蛋白在结直肠癌组织中的表达水平也低于正常癌旁组织。同时我们还发现GAP-43在高分化的结直肠癌组织中比在低分化组织中表达上升。这表明GAP-43基因在结直肠癌中表达下调或者发生了沉默。为了探究GAP-43基因在结直肠癌中表达沉默可能涉及的机制,本文采用重亚硫酸盐测序的方法,检查了结直肠癌细胞SW620、HCT116和结直肠癌临床患者的正常组织样本中GAP-43基因启动子的碱基甲基化水平。本文发现在以上两个结直肠癌细胞中,GAP-43基因启动子区域中多个CpG岛的胞嘧啶被甲基化。但在结直肠癌患者的正常组织中,这些CpG岛的胞嘧啶没有发生甲基化修饰;随后我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理结直肠癌细胞,并通过qRT-PCR发现,用该药物处理后,结直肠癌细胞中GAP-43 mRNA表达水平显著高于没有受药物处理的正常结直肠癌细胞。因此可以得出结论,GAP-43基因在结直肠癌中的表达是沉默的,这很可能是由其启动子区域中DNA的甲基化引起的。为了研究GAP-43对结直肠癌细胞表型的影响,本文成功构建了两种GAP-43过表达细胞系SW620/GAP43和HCT116/GAP43,并以此为材料进行了系列表型实验。MTT增殖曲线测定和集落形成测定实验显示GAP-43表达上调后抑制结直肠癌细胞的增殖,Transwell小室实验揭示了GAP-43表达上调后结直肠癌细胞的迁移和侵袭。为了探索GAP43可能参与结直肠癌细胞的信号转导途径,本文进行了过表达的结直肠癌细胞的转录组测序。并使用生物信息软件对测序结果进行分析,发现了FILP1L、KRT6A、S100A14等多个差异表达基因,KEGG富集分析显示,这些差异表达较高的基因主要聚集在ABC转运蛋白,神经活性配体-受体相互作用等通路,但差异表达较低的基因主要归类于核糖体和抗生素合成等通路。上述实验结果证明GAP-43基因的表达在结直肠癌中是沉默的,并且很有可能是由其启动子区域中DNA的甲基化修饰引起的;GAP-43的表达上调能够在很大程度上抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭;转录组测序分析发现了FILP1L、KRT6A、S100A14等差异表达基因,这些差异基因被富集在ABC转运体等信号通路中。