利用敲除PLCζ基因的JM8细胞制备嵌合体小鼠

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PLC是磷脂酰肌醇信号转导途径中非常重要的一个关键酶。而PLCζ则是磷脂酶C最短的一个同工酶,是结构和功能独立的新型PLC。通过研究发现PLCζ构型中催化区的链接点对受精的作用至关重要。PLCζ的发现可以作为细胞内Ca2+调节的一个新的介质,这更有利于我们理解大幅度、低频率的Ca2+波动的传播机制。将PLCζ当成精子因子的一部分有助于我们揭示卵母细胞被激活后,接下来不同胚胎发育阶段的分子机制。而要分析人类精子,PLCζ也能为了解一些雄性不育的情况提供一个新的框架。此外,PLCζ也可以用来改善卵母细胞的激活效率。因此,对PLCζ的研究也就越发重要。JM8细胞是敲除了PLCζ基因的一类干细胞系,是从C57BL/6N小鼠分离得到的,主要用于研究PLCζ的作用。本试验主要从JM8细胞入手,通过显微注射的方法得到嵌合体小鼠,然后通过微卫星分析来得到生殖系嵌合的小鼠,为深入研究PLCζ与Ca2+波动的关系打下基础。通过收集8-细胞胚胎,采用显微注射的方法将JM8细胞注入胚胎中,培养至囊胚后进行胚胎移植以获得嵌合体小鼠。对出生小鼠进行统计,发现得到了46只成年毛色嵌合体小鼠,占小鼠出生比例的36.22%。对嵌合体公鼠进行配种没有发现JM8细胞有生殖系传递的痕迹。对获得的成年嵌合体公鼠进行微卫星分析。提取10只成年嵌合体公鼠的12种组织(肺、肝、脑、胰、肠、膀、胃、心、睾丸、脾、肾、肌肉)的DNA,选取2个微卫星位点D10Mit134和D5Mit138进行PCR扩增,检测这10只成年嵌合体公鼠的组织嵌合度,尤其是生殖系嵌合的情况。结果发现嵌合体公鼠的大部分组织都发生了嵌合,甚至有一部分组织是完全由JM8细胞发育而来的。观察生殖系的嵌合情况,发现有4只公鼠的睾丸发生了嵌合,而另外有一只公鼠只在一个微卫星位点(D5Mit138)上检测到嵌合,在另一个微卫星位点(D10Mit134)上则没有检测到有嵌合的情况。检测的有生殖系嵌合的嵌合体公鼠通过配种却没有发现ES细胞有生殖系传递的痕迹,更进一步的机理则需要通过单精注射等实验手段来进行深入的研究。
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