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课题组前期研究结果发现:氟中毒可引起子代大鼠大脑皮层和海马神经元的病理学损伤、神经细胞凋亡、DNA损伤、学习认知能力下降以及细胞骨架相关蛋白MAP2的表达显著抑制。细胞骨架损伤在氟诱导智力紊乱过程中的作用如何?本研究以此为切入点,ICR小鼠和Neuro-2A细胞为研究对象,研究细胞骨架蛋白在氟中毒发生机制中的作用。1氟化钠对子代小鼠大脑皮层神经细胞骨架及突触相关蛋白表达的影响本研究通过自由饮用含氟水(0,50,100mg/L)建立氟中毒ICR子代小鼠模型,以0d,10 d,20 d,30 d,60 d和90 d子代小鼠大脑皮层为研究对象,研究细胞骨架损伤在氟致神经损伤过程中发挥的作用。采用水迷宫试验测定60 d子代小鼠学习记忆能力,结果显示氟处理组小鼠的学习记忆能力受到显著影响,潜伏期显著延长,并且穿过目标象限次数减少。HE染色观察到氟处理组大脑皮层锥体细胞数量减少,胶质细胞核皱缩和碎裂。氟暴露组小鼠大脑皮质MAP2、SYP和Dbn的mRNA和蛋白表达水平均不同程度受到抑制,谷氨酸受体蛋白的表达也出现下降趋势(P>0.05)。推断,氟抑制了骨架蛋白和突触相关蛋白表达,继而影响中枢神经系统信号的传递,最终引起子代小鼠学习记忆能力下降。2氟化钠对神经细胞骨架及神经信号传递的影响本研究以Neuro-2A细胞为试验对象,分别外源添加0,1,2,4,6mMNaF孵育24 h,探讨氟对神经细胞骨架损伤的影响。结果显示:氟暴露能降低神经细胞的存活率(P<0.05),细胞上清中LDH的含量增多(P<0.01),细胞膜的通透性增强,且呈现剂量依赖性;光学显微镜观察神经细胞形态,氟处理后神经细胞开始变圆,贴壁性差,细胞正常形态和突触逐渐消失,F-actin染色结果也证实了这一结果;利用透射电镜观察神经细胞超微结构的变化,发现:氟处理组神经细胞线粒体凝集,空泡化,细胞水肿,并呈现剂量依赖性。Western blot检测结果显示,NaF处理组MAP2和SYP的表达量显著下降(P<0.05),谷氨酸及其受体蛋白含量也受到明显抑制(P<0.05)。推测:NaF引起神经细胞骨架紊乱,导致突触数量和突触小泡蛋白表达量减少,从而影响了神经细胞信息传递功能。3氟对神经细胞RhoA/ROCK信号通路的影响为了探讨氟暴露对神经细胞中RhoA/ROCK信号通路的影响,本研究以子代小鼠大脑皮层和Neuro-2A为研究对象,研究NaF引起的神经细胞骨架损伤与RhoA/ROCK信号通路的关系。酵母双杂交结果发现MAP2与肌球蛋白有功能互作的可能性;利用鬼笔环肽和β-tubulin双染色法观察细胞骨架状态,发现:随着NaF浓度的增加,突触数量及分枝逐渐减少,微丝和微管由突触回缩至胞体,细胞核轮廓模糊不清,核固缩变小;Real-time PCR和Western blot检测细胞骨架相关蛋白Tau蛋白的表达,结果显示:与对照组相比,氟处理后神经细胞Tau mRNA水平逐渐下降(P>0.05),低剂量NaF处理组(1和2 mM NaF)神经细胞Tau蛋白水平显著升高但是高剂量组(4和6 mM NaF)又显著下降(P<0.01);体内试验结果显示子代小鼠大脑Tau mRNA水平略有上升,但其蛋白水平在大多数试验组普遍下降,其中10 d和60 d低氟组却显著性升高(P<0.05)。氟处理神经细胞后,低剂量NaF(1和2 mM)可激活RhoA/ROCK信号通路,但是高剂量NaF(4和6 mM)又能抑制蛋白水平的表达(P<0.05)。体内试验RhoA/ROCK信号通路显著被激活。ROCK抑制剂Y-27632处理Neuro-2A细胞,结果发现:与NaF单独处理组相比,Y-27632可抑制NaF引起的RhoA/ROCK信号通路激活,RhoA、ROCK和p-MLC的蛋白表达量均受到抑制;同时Y-27632与NaF共同孵育可提高神经细胞的存活率,并且神经细胞的突触丰富,轴突延长;氟中毒引起的神经细胞骨架蛋白MAP2与Tau的表达抑制也得到缓解(P<0.05)。结论:NaF能激活RhoA/ROCK信号通路,调控细胞骨架的重构,进而影响神经细胞突触可塑性及神经细胞功能的发挥。