卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，严重威胁女性生活和健康。近年来不同地域和种族的卵巢癌发病率逐渐增加。在我国，卵巢癌发病率为3.61～4.66/每10万，其中超过70％为上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）。由于卵巢深居盆腔，不易被发现，且早期卵巢癌常无特异性症状，以致超过75%的卵巢癌患者在确诊时就已进展到中晚期（Ⅲ/Ⅳ期），其死亡率已居女性生殖系统恶性肿瘤之首。目前，肿瘤细胞减灭术后继以铂类为基础的联合化疗是目前对中晚期卵巢癌的标准治疗方案。即使通过不断改进手术方法，优化化疗方案，长期以来晚期EOC的5年生存率始终徘徊在30%左右。现有化疗药物不敏感、易出现耐药、个别出现严重不良反应等都是其中常见的原因。长期以来人们致力于寻找开发新的抗癌药。抗癌新药一直是肿瘤治疗研究的热点，但研制抗癌新药投入极高，耗时又长。　　近年来，药物再定位（drug repositioning）受到越来越多的关注。药物再定位是指对已知生物安全、已掌握药物代谢动力学效应的药物，探寻新的药理效应，并且将药物适应症扩展到其它疾病。由于既有药物的药品安全及药代动力学已经过临床验证，药物再定位逐渐成为药品开发的新的有效途径。　　药物再定位在上个世纪九十年代就有报道，近年来相关研究逐渐增多，尤其是最近10年骤然升温。在镇静止痛、阿尔茨海默病、运动功能失调、抗结核、抗寄生虫、抗细菌、抗癌等领域都有关于药物再定位的研究报道。由于肿瘤病人，尤其是复发肿瘤患者，对新型抗肿瘤药物的需求迫切，且对抗肿瘤药物不良反应的耐受力和接受程度都较高，药物再定位更多的集中在抗癌领域，已然成为肿瘤治疗研究的新热点。反应停、阿司匹林、地高辛、二甲双胍等多种已长期广泛使用的药物经过严格的药物再定位研究，已经美国FDA批准增加新的适应症，用于多种恶性肿瘤的治疗。　　莫能霉素是一种具有五连环聚醚结构的离子载体型抗生素，广泛应用于家禽畜牧养殖，用以防治养殖动物球虫感染、促进反刍动物饲料营养吸收。其作用机制可能为：莫能霉素特异性地与Na+、K+、Ca2+等阳离子结合，助其迅速穿过细胞膜，使细胞内外电解质失衡，导致细胞代谢紊乱、乃至死亡。　　随着药物再定位成为肿瘤治疗研究的热点，对莫能霉素抗肿瘤作用的研究也受到更多的关注。近年来研究发现，莫能霉素在多种恶性肿瘤中具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖迁移的作用，其可能的作用途径涉及wnt/β-catenin信号通路（结直肠癌）、雄激素受体信号通路（前列腺癌）等通路。还有人观察到莫能霉素与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）抑制剂及表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂具有协同作用。目前国内外尚未发现莫能霉素在卵巢癌中的作用及机制的研究报道。课题组在前期工作中，发现莫能霉素能抑制癌细胞的增殖，提示莫能霉素有对卵巢癌的治疗潜力。因此，课题组分为以下三部分对莫能霉素在卵巢癌中的作用及机制进行初步研究。　　第一部分莫能霉素对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响　　目的：检测莫能霉素对EOC细胞增殖、迁移、凋亡、细胞周期、裸鼠皮下移植瘤成瘤能力等癌细胞恶性生物学行为的影响，证实莫能霉素对EOC细胞生长的抑制能力。　　方法：　　（1）采用台盼蓝染色活细胞计数、WST-1法、结晶紫染色法检测莫能霉素对EOC细胞的细胞毒性，并抑制其增殖生长。　　（2）采用细胞划痕实验、细胞间隙封闭实验检测莫能霉素作用前后 EOC细胞迁移能力的变化。　　（3）采用Hoechst染色、流式细胞周期分析、流式细胞凋亡分析检测莫能霉素作用前后EOC细胞凋亡率、及细胞周期分布的变化。　　（4）将萤火虫荧光素酶基因导入HeyA8细胞，稳定表达，构建EOC裸鼠皮下移植瘤模型，以小动物活体成像及传统方法检测莫能霉素作用前后EOC细胞皮下成瘤能力的改变。　　结果：　　（1）莫能霉素对EOC细胞具有细胞毒性，并能抑制其增殖生长台盼蓝染色活细胞计数实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后，SKOV3和HeyA8两种EOC活细胞数均显著性减少，且药物浓度越高，剩余活细胞数越少（P<0.05）。　　WST-1分析实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后，SKOV3和HeyA8两种细胞株OD值显著降低，药物浓度越高，OD值越低（P<0.05）。　　结晶紫染色实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后两种细胞染色明显变浅，将染色的细胞经乙酸洗脱后经分光光度计测得 OD值显著降低，莫能霉素浓度越高，差异越大（P<0.05）。　　（2）莫能霉素能抑制EOC细胞的迁移能力　　细胞划痕实验结果显示，莫能霉素处理组的划痕闭合速度较对照组显著性减慢（P<0.01），尤其在药物处理36小时后，对照组划痕几近完全闭合，而药物处理组仍有明显划痕存在。　　细胞间隙闭合实验结果显示，SKOV3和HeyA8两种细胞株中莫能霉素处理组的间隙闭合程度显著性差于对照组（P<0.01）。　　（3）莫能霉素能诱导EOC细胞凋亡、引起细胞周期停滞　　Hoechst染色实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后的 SKOV3和HeyA8细胞在镜下观察到的凋亡细胞显著增多，药物浓度越高，凋亡率越高（P<0.05）。　　流式细胞凋亡分析实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后的SKOV3细胞的早期凋亡率显著性增高（P<0.05）。　　流式细胞周期分析实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素处理后的SKOV3、HeyA8细胞的处于增殖期的细胞显著性减少（P<0.05）。　　（4）莫能霉素能抑制裸鼠皮下移植瘤成瘤能力　　成功地将萤火虫荧光素酶基因导入HeyA8细胞，筛选出稳定表达细胞株，并构建EOC裸鼠皮下移植瘤模型。　　小动物活体成像实验结果显示，与未加药对照组相比，莫能霉素作用后裸鼠皮下移植瘤的荧光强度显著性降低（P<0.05），莫能霉素浓度越高，荧光强度降低越多。　　处死裸鼠后收集皮下移植瘤结节，发现莫能霉素处理组的皮下移植瘤瘤体显著性小于对照组，（P<0.05）。　　结论：莫能霉素能抑制 EOC细胞增殖、迁移，能诱导 EOC细胞凋亡、促进细胞周期停滞，能抑制EOC细胞在裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力。证实了莫能霉素对卵巢癌细胞生长的抑制能力，具有成为卵巢癌抗癌新药的潜力。　　第二部分莫能霉素对上皮性卵巢癌作用机制研究　　目的：探讨莫能霉素对上皮性卵巢癌增殖、转移侵袭等恶性行为的可能分子机制。　　方法：　　（1）采用细胞免疫荧光染色、萤火虫荧光素酶报告基因系统及 Gaussia荧光素酶报告基因系统对文献报道的wnt/β-catenin信号通路进行验证。　　（2）分别在常规培养、人工诱导缺氧环境、EGF刺激等多种条件下，采用Gaussia荧光素酶报告基因系统筛选12条肿瘤相关信号通路，检测莫能霉素作用前后荧光强度的变化，筛选可能的信号通路。　　（3）采用实时定量PCR，检测莫能霉素作用前后SKOV3细胞中相关基因转录的变化，对筛选出的信号通路进行验证。　　（4）采用免疫荧光染色和免疫组化染色，检测人卵巢癌组织中相关信号通路的表达情况。　　（5）采用免疫荧光染色和免疫组化染色，检测莫能霉素作用前后 SKOV3细胞中相关信号通路受体表达的改变。　　（6）采用免疫荧光染色和免疫组化染色，检测不同浓度莫能霉素作用的裸鼠皮下移植瘤组织中相关信号通路受体表达的改变。　　结果：　　（1）莫能霉素在EOC中发挥作用与wnt/β-catenin信号通路无关　　细胞免疫荧光实验结果显示，不同浓度莫能霉素作用前后，SKOV3细胞中β-catenin的荧光强度未见明显改变。　　萤火虫荧光素酶报告基因系统实验结果显示，莫能霉素作用前后，SKOV3细胞中wnt/β-catenin的荧光读数未见显著性改变。　　Guassia荧光素酶报告基因系统实验结果显示，莫能霉素作用前后， SKOV3细胞中wnt/β-catenin的荧光读数未见显著性改变。　　（2）我们采用Guassia荧光素酶报告基因从12个肿瘤相关信号通路中筛选出7个可能涉及莫能霉素作用于卵巢癌机制的信号通路的基因转录的变化，它们是：Elk1/SRF、AP1、myc/max、STAT1/2、CREB、NFκ B、GR。其中前5个基因：Elk1/SRF、AP1、myc/max、STAT1/2、CREB，都涉及EGFR信号通路。由此假设，莫能霉素作用于卵巢癌的机制可能与EGFR信号通路有关。后续实验就围绕EGFR信号通路开展。　　（3）实时定量PCR实验结果显示，与对照组相比，莫能霉素作用后，SKOV3细胞中 EGFR及其下游基因 stat3、c-myc的转录都显著性减少，与细胞周期和抑制细胞凋亡相关的CyclinD1和BCL2基因转录也显著性减少（P<0.05）。　　（4）免疫荧光染色及免疫组化染色实验结果显示，25例人上皮性卵巢癌组织中17例EGFR高表达，占68%，与文献报道一致；与对照相比，莫能霉素处理后SKOV3细胞中EGFR表达显著减弱，药物浓度越高，减弱越明显；与对照组相比，莫能霉素处理后的裸鼠皮下移植瘤组织中，反应细胞增殖状态的 PCNA表达显著降低，EGFR表达也显著降低。　　结论：莫能霉素抑制 EOC细胞生长与wnt/β-catenin信号通路无关；莫能霉素抑制EOC细胞生长与EGFR信号通路有关，莫能霉素可能作为EGFR抑制剂发挥抑制上皮性卵巢癌的作用。　　第三部分莫能霉素与其它药物对上皮性卵巢癌的联合作用　　目的：探讨莫能霉素与其它药物（多种酪氨酸激酶抑制剂、临床一线抗癌药等）对上皮性卵巢癌的联合作用。　　方法：　　（1）采用WST-1法检测莫能霉素分别与三种酪氨酸激酶抑制剂（染料木素、AG-490、厄洛替尼）及奥沙利铂在抑制 SKOV3细胞增殖中的联合作用，运用CompuSyn软件进一步分析wst-1实验数据，计算联合指数（CI）及剂量降低指数（DRI）。　　（2）采用流式细胞周期分析莫能霉素与染料木素、AG-490在促使SKOV3细胞周期停滞中的联合作用。　　（3）采用结晶紫染色检测莫能霉素与奥沙利铂在抑制 SKOV3细胞增殖中的联合作用。　　（4）采用流式细胞凋亡分析检测莫能霉素与奥沙利铂在诱导细胞凋亡中的联合作用。　　结果：　　（1）莫能霉素与酪氨酸激酶抑制剂在抑制 SKOV3细胞增殖方面存在协同作用。　　WST-1法实验结果显示，与对照相比，莫能霉素联合应用三种酪氨酸蛋白激酶抑制剂（染料木素、AG-490、厄洛替尼）处理 SKOV3细胞后 OD值显著降低（P<0.05）；用 CompuSyn软件进一步分析显示染料木素、AG-490、厄洛替尼分别与莫能霉素的CI值都小于1，且大多在0.5上下波动。　　（2）莫能霉素与奥沙利铂在抑制 SKOV3细胞增殖方面存在协同作用，莫能霉素能显著降低奥沙利铂的使用剂量。　　WST-1法实验结果显示，与对照相比，莫能霉素联合奥沙利铂处理 SKOV3细胞后，OD值显著性降低（P<0.05）；CompuSyn软件进一步分析显示奥沙利铂与莫能霉素的CI小于1，DRI在1.5-3.7范围波动，平均值约等于2，说明两者存在协同作用，且莫能霉素能使奥沙利铂的使用剂量减少1/2。　　（3）流式细胞周期分析实验结果显示，与对照相比，莫能霉素联合染料木素、AG-490促使SKOV3细胞周期停滞的作用显著性增强（P<0.05）。　　（4）采用结晶紫染色实验结果显示，与对照相比，莫能霉素联合奥沙利铂在抑制SKOV3细胞增殖中的作用显著性增强（P<0.05）。　　（5）流式细胞凋亡分析实验结果显示，与对照相比，莫能霉素联合奥沙利铂在诱导SKOV3细胞凋亡中的作用显著性增强（P<0.05）。　　结论：莫能霉素与酪氨酸激酶抑制剂在抑制EOC细胞增殖、促进细胞周期停滞、诱导细胞凋亡中有协同作用；莫能霉素与奥沙利铂在抑制EOC细胞增殖、促进细胞周期停滞、诱导细胞凋亡中有协同作用，还能降低卵巢癌治疗中奥沙利铂的使用剂量。