目的:　　本文应用高通量测序以及基因组生物信息分析，以临床分离的不同年份的铜绿假单胞菌(PA)为研究对象，研究已经报道过的所有氨基糖苷类耐药基因在PA中的分布情况;并发掘PA中氨基糖苷类耐药新基因型，克隆候选基因，通过药敏试验来验证新基因型的功能。进一步对该基因进行生物信息学分析，为铜绿假单胞菌所携带的耐药基因分布规律、传播机制研究打下基础。　　方法:　　本课题以温州医科大学附属第一医院临床分离得到的239株PA为样本，提取其混合基因组，并送至北京中科院基因组研究所进行solexa测序。通过一系列生物信息学工具，将测序得到的短序列与收集到的151条已报道氨基糖苷类耐药基因序列比对分析，研究这151条氨基糖苷类耐药基因在PA中的分布情况及丰度差异。同时进一步发掘新的耐药基因型，选取其中的aadA4基因型为代表，设计引物PCR定位该基因所在的菌株。PCR筛选出的阳性菌株中的aadA4基因，对其进行生物信息分析，研究该基因的同源性和分子进化。将aadA4新基因型片段连接到T载体，转入大肠杆菌JM109，提取重组子质粒进行双酶切，再将片段连接到pET-15b载体，转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21，涂布于含Amp平板上进行培养，筛选阳性菌株pET∷aadA4/BL21。然后通过琼脂倍比稀释法测定pET∷aadA4/BL21对17种药物的MIC值，来验证铜绿假单胞菌中aadA4新基因型的功能。同时药敏试验也研究了选取的45株铜绿假单胞菌对17种药物的MIC值，观察该院分离的铜绿假单胞菌的对抗生素的耐药性情况以及分析aadA4基因阳性株与阴性株耐药性的差异。　　结果:　　1.铜绿假单胞菌混合基因组高通量测序结果产生的短序列reads总数有70，239，195条，reads的长度均为100nt。将reads比对到151条氨基糖苷类耐药基因序列上，最后发现有25个基因型存在于铜绿假单胞菌中。其中丰度最高的基因型为aph(3)-Ⅱb，丰度有1636.218X，覆盖度99.88％;丰度最低的基因型是aadA412，丰度有2.2X，覆盖度80.1％。　　2.从239株铜绿假单胞菌中，PCR筛选出两株菌TL1229、TL1285，包含有aadA4基因型，其余铜绿假单胞菌均不含aadA4基因型。　　3.PCR产物测序结果分析，TL1229与TL1285中的aadA4基因型比对identity为100％，TL1229、TL1285中的aadA4基因型与参照序列aadA4比对identity为95％，且发生了氨基酸水平的差异。　　4.aadA4新基因型进行进化树分析，发现与大肠杆菌中的YP_190214蛋白亲缘关系最近，铜绿假单胞菌中aadA4基因的来源可能是由大肠杆菌水平转移而来。　　5.成功将aadA4基因连接到pET-15b表达载体，并成功构建表达目的重组菌pET∷aadA4/BL21。　　6.MIC功能验证，TL1229、TL1285中发现的aadA4新基因型对链霉素、大观霉素和新霉素的MIC值比对照组高出4个浓度梯度左右，对其他抗生素则没有明显的作用。　　7.医院分离的铜绿假单胞菌对链霉素、大观霉素、核糖霉素、头孢唑啉钠、氨苄西林钠和替卡西林具有很强的耐药作用，MIC值达到了1024μg/mL以上。TL1285、TL1185、TL1208、TL1288、TL1289这五株菌几乎对所有的药物MIC都很高，相比于其它铜绿假单胞菌，尤其对卡那霉素、妥布霉素、新霉素、庆大霉素、西索米星、小诺米星、阿米卡星、奈替米星的MIC值均达到了128μg/mL以上。　　结论:　　1.高通量测序技术和生物信息工具的结合，能使我们在短时间内测定上百株细菌的核酸序列，通过对病原菌序列进行大规模分析来探索基因组序列结构与病原微生物的耐药性的关系，对于致病菌中耐药基因的分布及新基因的发掘和功能研究起着极为有效的作用，为新药的研制开发提供了新的思路。　　2.温州医科大学附属第一医院分离的铜绿假单胞菌中含有丰富的氨基糖苷类耐药基因，并且已经产生多重耐药菌株。　　3.铜绿假单胞菌菌株TL1229、TL1285中发现的aadA4新基因型除了介导已经报道过的对链霉素和大观霉素的耐药，对新霉素也具有耐药作用。