耳蜗毛细胞的变性、坏死、缺失是感音神经性聋的主要原因之一。目前临床上对绝大多数感音神经性聋仍缺乏确切有效的治疗，其根本原因在于哺乳类内、外毛细胞是终末分化细胞，损伤后不能再生。但是近年来，在哺乳动物毛细胞再生研究上取得了一些进展：经维甲酸处理的体外培养的胚胎耳蜗，或在正常无血清培养基中培养的胚胎耳蜗，或某一特定基因缺陷的小鼠能产生额外内毛细胞和／或外毛细胞。这给感音神经性聋患者带来了希望，将来可能用再生毛细胞替代疗法来治疗感音神经性聋。 最近，大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）成为哺乳动物毛细胞再生研究一个新的热点。研究表明：毛细胞分化的正性调控基因Math1在体外培养的大鼠耳蜗中过度表达后，能诱导大上皮嵴形成大量新生毛细胞；一些参与毛细胞分化和再生的重要基因如Hes1、Hes5，生长因子受体如FGFR1等也在大上皮嵴表达。这些研究结果证明大上皮嵴是一个重要的细胞群，有可能是耳蜗毛细胞的前体细胞池之一。目前对大上皮嵴了解不多，本课题对不同年龄段的胚胎和新生大鼠耳蜗进行冰冻切片，然后苏木素—伊红染色观察大上皮嵴的形态演变。 再生可能是重复正常发育中的毛细胞分化过程。这样，理解毛细胞的分化机理，就有助于促进毛细胞的再生。毛细胞的分化过程受一定数量的特定基因的调控。p27^Kip1，一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI），在调节Corti氏器细胞增殖方面起重要作用。胚胎发育过程中，表达p27^Kip1的细胞斑停止分裂，退出细胞周期，形成前感觉斑，建立了确定数量的前感觉细胞，毛细胞从中得以分化。本课题对不同时期的大鼠耳蜗大上皮嵴中p27^Kip1表达情况进行观察，探讨p27^Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用。 一、大鼠耳蜗大上皮嵴的形态学演变军医进修学院硕士论文中文摘要 选取胚胎期14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等10个年龄段的大鼠耳蜗（记作E14、E16、E18、E20、PO、PZ、PS、P7、P10、P14），经过固定、脱水、包埋等处理后，进行冰冻切片和HE染色。分别比较同一年龄段耳蜗的顶、中、底回蜗管和不同年龄段耳蜗的同回蜗管，从而观察胚胎期和新生期大鼠耳蜗大上皮峭形态上的变化。结果表明:胚胎期14天前后是大上皮靖形态演变的关键时期，其外侧区域凹陷，开始形成原始柯蒂氏器，毛细胞和支持细胞从中分化。毛细胞的分化、成熟是从底回向顶回进行，顶回较底回有1一2天的延迟。胚胎期20天时能够清楚地辨认出分化中的毛细胞和支持细胞。大上皮靖结构重排、细胞数目减少从腔侧开始，在靠近腔侧的部分大上皮峭细胞中可见核浓缩、核碎裂等细胞死亡征象。出生后2周左右，大上皮靖消失，形成内螺旋沟，此时毛细胞分化成熟。 二、p27Ki”，在不同时期的大鼠耳蜗大上皮蜡上的表达 以1:100抗p27Ki”‘小鼠单克隆抗体为一抗，1:200异硫氰酸荧光素（nuoreseein 150出ioeyanate，FITe）标记山羊抗小鼠IgG为二抗，采用间接法，对E 12、E13、E14、E16、E18、E20、PO、PZ、PS、P7、P10、P14等12个年龄段的大鼠耳蜗进行免疫荧光组织化学检查，观察p27KIP’在大上皮峭中的表达情况。抗p27Kip，阳性细胞其胞核呈黄绿色荧光。结果表明:胚胎期14天时，P27物‘开始在蜗管表达，而且其表达限于蜗管腹正中壁的增厚部分，即原始柯蒂氏器。原始柯蒂氏器中全部细胞均着色，而大上皮峭中未见p27KIP’表达。胚胎期20天左右时，p27肠’开始在大上皮峭细胞和支持细胞表达，而在毛细胞中停止表达，此时内、外毛细胞和4种支持细胞在形态上能被清楚地辨认出来。出生后7天时，p27KIPI在大上皮峭的表达达到最强，之后其表达减弱，直至出生后2周时大上皮峭结构消失。p27Ki”‘在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达。