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第一部分微粒携带的miR-155在异基因造血干细胞移植受者急性移植物抗宿主病的表达及意义目的:研究微粒(MPs)携带的microRNA-155(miR-155)在急性移植物抗宿主病(aGVHD)患者中的表达水平及意义。方法:采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测28例行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗后发生aGVHD患者及30例未发生aGVHD(非aGVHD)患者各时间点(移植前、+7天、+14天、+21天、+28天及aGVHD发生时)外周血MPs、血浆中miR-155的表达水平;采用T细胞分选试剂盒分离aGVHD及非aGVHD患者上述时间点外周血中T细胞,qRT-PCR方法检测两组患者各时间点T细胞中miR-155的表达水平;比较两组患者各时间点外周血MPs、血浆及T细胞中miR-155表达水平的差异;比较aGVHD患者各时间点MPs、血浆及T细胞中miR-155表达水平的差异。结果:与移植后非aGVHD患者比较,aGVHD患者在+7天、+14天、+21天、+28天时外周血MPs、血浆中miR-155的表达水平明显升高,且外周血MPs中miR-155的表达水平升高更显著;对于aGVHD患者而言,外周血MPs中miR-155的表达水平在+7天、+14天、+21天、+28天及aGVHD发生时较移植前明显升高,血浆中miR-155的表达水平在+7天、28天及aGVHD发生时较移植前明显升高;移植后非aGVHD与aGVHD患者T细胞中miR-155的表达水平在移植前、+7天、+14天、+21天、+28天均无明显差别,aGVHD患者T细胞中miR-155的表达水平在aGVHD发生时显著高于移植前水平。结论:外周血中MPs携带的miR-155可在aGVHD症状出现之前早期预测aGVHD的发生,可作为诊断及预测aGVHD的敏感的生物学指标。第二部分内皮微粒携带的miR-155对T细胞功能的影响及其作用机制的体外研究目的:在体外实验中探讨内皮微粒(EMPs)携带的microRNA-155(miR-155)对T细胞生物学功能的影响及其作用机制。方法:采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)比较肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)EA.hy926细胞产生的EMPs及EA.hy926细胞中miR-155表达水平的差异;采用激光共聚焦显微镜观察携带miR-155的EMPs(双荧光标记的EMPs)与T细胞的融合过程;使用内皮细胞保护剂辛伐他汀预先处理EA.hy926细胞,设计合成miR-155特异性抑制剂antagomir-155,并将其转染至EA.hy926细胞,下调miR-155的表达,后使用TNF-α刺激各组EA.hy926细胞产生EMPs,实验设置正常对照组,EMPs组,辛伐他汀-EMPs组,antagomir-155-EMPs 组,antagomir-NC-EMPs 组,将五组 EMPs 分别加入T细胞,作用72小时后,qRT-PCR检测T细胞中miR-155的表达;CFSE检测T细胞的增殖;Annexin V FITC/PI双染法流式细胞术检测T细胞的凋亡;Western blot检测T细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测T细胞培养上清中细胞因子的含量;流式细胞术检测T细胞亚群的分化。结果:①TNF-α刺激EA.hy926细胞产生的EMPs中miR-155的表达水平明显高于EA.hy926细胞本身miR-155的水平;②激光共聚焦显示双荧光标记的携带miR-155的EMPs可进入T细胞胞浆;③辛伐他汀可明显减少TNF-α刺激EA.hy926细胞产生的EMPs,从而改变T细胞中miR-155的表达水平;④抑制EMPs中的miR-155可明显降低T细胞中miR-155的表达水平;⑤阻断EMPs中miR-155不影响T细胞的增殖;⑥抑制EMPs中miR-155不影响T细胞的凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达;⑦阻断EMPs中miR-155可显著抑制T细胞向Th1、Th9、Th17细胞分化,促进T细胞向Th2及Treg细胞分化。结论:EMPs可携带miR-155进入T细胞胞浆,不影响T细胞的增殖及凋亡,但促进T细胞向Th1、Th9、Th17细胞分化,抑制T细胞向Th2及Treg细胞分化。第三部分内皮微粒携带的miR-155参与aGVHD及其作用机制的体内研究目的:在体内实验中探讨内皮微粒(EMPs)携带的microRNA-155(miR-155)参与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用及其相关机制。方法:构建同种异体造血干细胞移植后aGVHD小鼠模型,流式细胞术检测单纯骨髓细胞(BM)组及aGVHD组小鼠不同时间点(移植前、+4天、+8天、+12天、+16天及aGVHD发生时)外周血EMPs的含量及其变化;采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BM组及aGVHD组小鼠上述不同时间点外周血微粒、血浆及T细胞中miR-155的表达水平:后将实验分为八组:①BM组:给予全身照射(TBI)后的BALB/c受鼠输注C57BL/6供鼠的骨髓细胞;②aGVHD组:给予TBI后的BALB/c受鼠输注C57BL/6供鼠的骨髓细胞及脾脏细胞混合物;③EMPs组:将TNF-α刺激小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)产生的EMPs给予aGVHD小鼠;④辛伐他汀-EMPs组:将TNF-α刺激辛伐他汀(2.5μmol/L)预先保护的MAECs细胞产生的EMPs给予aGVHD小鼠;⑤antagomir-155-EMPs 组:将 TNF-α刺激预先转染 antagomir-155 的 MAECs 细胞产生的EMPs给予aGVHD小鼠;⑥antagomir-NC-EMPs组:将TNF-α刺激预先转染antagomir-NC的MAECs细胞产生的EMPs给予aGVHD小鼠;⑦antagomir-155 组:向 aGVHD 小鼠尾静脉输注 antagomir-155;⑧antagomir-NC组:向aGVHD小鼠尾静脉输注antagomir-NC;+7天时给予antagomir-155或antagomir-NC 25mg/kg,以后每周尾静脉注射两次,每次5mg/kg,直至移植后+21天;各组EMPs(60μg/天)均在0天及+7天给予aGVHD小鼠;观察各组小鼠生存期及aGVHD表现的差异;HE染色观察各组小鼠脏器病理变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组小鼠血清中Th 1(IFN-γ、TNF-α)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)、Th9(IL-9)、Th17(IL-17A)细胞因子的含量;流式细胞术检测各组小鼠外周血T细胞亚群分化的情况。结果:①aGVHD小鼠外周血EMPs的比例在移植后+8天、+12天及+16天显著高于BM组小鼠,在aGVHD发生时稍下降;②aGVHD小鼠外周血MPs携带的miR-155的表达水平在+4天、+8天、+12天、+16天及aGVHD发生时均显著高于BM组小鼠,且aGVHD小鼠外周血MPs携带的miR-155的表达水平明显高于血浆;③aGVHD小鼠外周血T细胞中miR-155在+16天及aGVHD发生时均显著高于BM组小鼠;且aGVHD小鼠外周血MPs中miR-155的表达高峰明显早于T细胞;④尾静脉给予高剂量EMPs可显著加重aGVHD的表现,加重aGVHD受累器官的病理损伤,明显缩短生存期,增加死亡率。尾静脉输注抑制miR-155的EMPs可显著逆转上述现象。尾静脉给予TNF-α刺激辛伐他汀预先保护的MAECs细胞产生的EMPs可改善aGVHD的表现,减轻aGVHD相关病理损伤,明显延长生存期,降低死亡率;⑤尾静脉给予高剂量EMPs使aGVHD小鼠血清中Th1、Th9及Th17型细胞因子含量升高,aGVHD小鼠CD4+/CD8+T细胞及Th17比例增高,Treg比例下降,尾静脉给予抑制miR-155的EMPs可显著逆转细胞因子及细胞亚群的异常变化。结论:本部分体内实验表明MPs携带miR-155的表达水平可作为aGVHD的早期预测指标及治疗靶点。EMPs通过携带miR-155促进T细胞向Th1、Th9、Th17细胞分化,抑制T细胞向Th2及Treg细胞分化,进而参与及加重aGVHD。