第一部分4种冷冻复苏方法对家兔卵巢组织形态学及卵母细胞PCNA表达的影响目的:观察4种冷冻复苏方法对家兔卵巢组织形态学及卵母细胞PCNA表达的影响,探讨适宜的卵巢组织冷冻复苏方案。方法:将12只健康日本大耳白家兔随机分为4组,分别采用PROH(PROH组)及DMSO(DMSO组)慢速程序化冷冻和DMSO+PROH(玻璃化组1)及DMSO+EG(玻璃化组2)玻璃化冷冻方法冻存家兔卵巢组织,液氮保存一月后复苏,分别行HE染色及免疫组化染色,观察冷冻复苏后卵巢组织结构和各级卵泡形态学的改变及始基和初级卵泡卵母细胞PCNA表达的变化。结果:1. 4种冷冻复苏方法使家兔卵巢组织始基卵泡和初级卵泡的形态正常率分别下降为80.08%和55.00%、70.53%和52.94%、67.55%和47.06%及69.65%和55.56%而其相应新鲜对照组始基卵泡和初级卵泡的形态正常率分别为90.14%和86.05%、91.45%和89.29%、91.76%和84.62%及92.15%和89.47%,差异均有显著性(P<0.05);PROH组始基卵泡形态正常率最高,达80.08%,与DMSO组(70.53%)、玻璃化组1 (67.55%)、玻璃化组2 (69.65%)比较,差异均有显著性(P<0.05)。各冷冻组合并后计算始基卵泡的形态正常率为72.70%,初级卵泡的形态正常率为52.77%,二者比较,差异有显著性(P<0.05)。4个冷冻组均可见卵巢组织结构受损的表现,镜下可见部分卵泡与周围间质细胞分离,间质细胞连接变得疏松,排裂紊乱,有裂隙形成。2.免疫组化染色结果显示冷冻组中PROH组始基及初级卵泡卵母细胞PCNA的阳性率最高达76.98%,玻璃化组2次之,为72.44%,与新鲜对照组比较(78.04%)差异无显著性(P>0.05),而DMSO组(58.97%)及玻璃化组1(48.00%)PCNA阳性率较新鲜对照组明显降低(P<0.05)。结论:1. 4种冷冻复苏方法均对家兔卵巢组织结构造成一定程度的损伤,使各级卵泡的形态正常率明显下降,出现间质受损的表现。2. PROH慢速程序化冷冻法明显优于DMSO慢速程序化法及玻璃化法,较适合卵巢组织中始基卵泡的保存。3.冻存卵巢组织对初级卵泡的影响大于始基卵泡。4. PROH慢速程序化冷冻及DMSO+EG玻璃化冷冻能较好地保持家兔卵巢组织中始基及初级卵泡卵母细胞的增殖活性。第二部分慢速程序化冷冻及玻璃化冷冻方案对家兔卵巢组织超微结构、ER和MHC-Ⅱ类抗原的表达及卵泡细胞增殖活性的影响目的:观察PROH慢速程序化冷冻及DMSO+EG玻璃化冷冻对家兔卵巢组织超微结构、ER和MHC-Ⅱ类抗原表达及卵泡细胞增殖活性的影响,判断复苏后卵巢组织抗原性和免疫原性是否发生改变,为今后卵巢组织移植及体外培养的研究奠定基础。方法:1、将健康日本大耳白家兔9只随机分为3组,1组为新鲜对照组,另2组为冷冻组。冷冻组分别采用PROH慢速程序化冷冻及DMSO+EG玻璃化冻存方案冻存家兔卵巢组织。2、复苏后透射电镜观察两种冷冻方法对家兔卵巢组织超微结构的影响。3、SP免疫组化法观察两种方法对家兔卵巢组织ER及MHC-Ⅱ类抗原表达的影响。4、机械性分离新鲜组及冷冻组复苏的组织块,分离下的卵泡按直径的大小再分为:小OGC组,直径100~150μm,有2~5层颗粒细胞包裹的小次级卵泡;大OGC组,直径200~300μm,有5层以上颗粒细胞包裹的大次级卵泡。每组分别取20个形态正常的OGC,行3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入试验。结果:1、PROH组始基卵泡卵母细胞部分线粒体肿胀,呈空泡状;部分线粒体形态尚正常;细胞核形态正常,核膜完整,界线清晰;颗粒细胞核膜完整,胞质内线粒体形态正常,细胞间缝隙连接完好。DMSO+EG组,始基卵泡卵母细胞线粒体肿胀,细胞器崩解;细胞形态尚可,边界清晰,核膜完整。周围颗粒细胞内线粒体尚可,间质细胞线粒体肿胀明显,呈空泡状。2、免疫组化结果显示,两冷冻组复苏后家兔卵巢组织ER的表达与新鲜对照组比较,无明显变化(P>0.05)。DMSO+EG玻璃化冷冻组MHC—Ⅱ类抗原的表达与新鲜对照组比较明显下降(P<0.05),PROH组无明显变化(P>0.05)。.3、两冷冻组复苏后小OGC的cpm值与新鲜对照组比较,无明显差异(P>0.05),而大OGC的cpm值较新鲜对照组明显下降(P<0.05)。结论:1. PROH慢速程序化冷冻对家兔卵巢组织超微结构的影响小于DMSO+EG玻璃化冷冻。2.两种冷冻复苏方法,对家兔卵巢组织ER的表达均无明显影响。3. DMSO+EG玻璃化冷冻复苏明显降低了卵巢组织的免疫原性。4.两种冷冻复苏方法对形态结构完整的小OGC增殖活力无明显影响,这些卵泡体外生长和成熟,可能更容易成功。多层颗粒细胞包裹的大OGC即便形态正常,其增殖活性也明显受到抑制。第三部分家兔卵巢组织冷冻保存后体外培养的研究目的:探讨适宜的卵巢组织体外培养方法。方法:1.无菌条件下取新鲜家兔卵巢组织,复苏PROH慢速程序化冷冻保存的家兔卵巢组织,分别采用部分分离培养及组织块培养方法体外连续培养14d,作为新鲜部分分离培养组、新鲜组织块培养组、冷冻部分分离培养组、冷冻组织块培养组。2.每隔1天倒置显微镜下观察培养情况,并收集组织培养液500μl待测E2,同时补入新鲜培养液500μl。采用酶免法检测各组E2分泌量的变化。培养14d结束时机械性分离各组卵巢组织,将形态结构完整,颗粒细胞连续,折光性好的大OGC(直径200~300μm,有5层以上颗粒细胞包裹的大次级卵泡)和小OGC(直径100~150μm,有2~5层颗粒细胞包裹的小次级卵泡)每组分别各取20个,进行3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入试验。结果:1.倒置显微镜下新鲜及冷冻部分分离培养组均可见单层颗粒细胞包裹的小卵泡,连续培养14d,未见明显生长,卵泡内出现黑色颗粒,有退化坏死的迹象。2.新鲜及冷冻部分分离培养组,培养14d后机械性分离卵巢组织均可见窦卵泡形成,进一步分离得到GV期卵子,未得到MⅡ期卵子。3.新鲜及冷冻组织块培养组,14d培养结束时未见到有明显窦腔的卵泡形成。4.各培养组E2分泌量的变化:新鲜组织块组,第6天E2分泌量达高峰,第8天开始逐渐下降;冷冻组织块组E2分泌量持续下降;而新鲜及冷冻部分分离培养组E2分泌持续上升。5. 3H标记胸腺嘧啶核苷掺入试验结果:新鲜及冷冻部分分离培养组和新鲜组织块组所得到的小OGC其cpm值均无明显差异(P>0.05),而冷冻组织块得到小OGC的cpm值较以上各组明显降低(P<0.05)。6.冷冻组织块组培养结束时,未得到形态正常的大OGC。新鲜及冷冻部分分离培养所得到的形态正常的大OGC其cpm值无明显差异(P>0.05),而新鲜组织块组所得到的大OGC的cpm值较上两组明显下降(P<0.05)。结论:1.部分分离法体外培养新鲜及冷冻的家兔卵巢组织明显优于组织块培养法。体外培养14d,前者培养液中E2呈上升趋势,有窦卵泡形成;后者随培养时间的延长E2呈下降趋势,未见窦卵泡形成。2.新鲜及冷冻组织部分分离培养所得到的形态正常的大小OGC均有良好的增殖活性,说明PROH慢速程序化冷冻较好地保存了存活卵泡的体外发育潜能。3.该培养系统不适合家兔卵巢组织始基及初级卵泡的体外培养。4.冷冻卵巢组织更不适合组织块培养,所得到的形态正常的小OGC增殖活性差,未得到形态正常的大OGC。第四部分家兔卵巢组织移植的研究目的:探讨适宜的卵巢组织移植部位,观察移植成活物的生理功能。方法:1.选健康大耳白家兔20只随机分为对照组(5只)、去势组(5只)、移植组(10只)。2.移植组选宫旁阔韧带为移植部位,将切下的双侧卵巢去除髓质,切成1×1×1mm3大小的组织块植入左侧阔韧带的浆膜下,移植术后隔日肌注HMG 10IU/天,至术后半月。去势组切除双侧卵巢。3.术后第2天开始隔日行阴道脱落细胞学涂片,观察雌激素水平的变化,至术后一个半月。4.术后一月开始,每只家兔每隔5日,连续3次取耳缘静脉血2ml,酶免法测定血清E2水平。5.术后1个半月再次开腹,取对照组子宫内膜及卵巢;取去势组子宫内膜;取移植组的成活移植物及子宫内膜,做HE染色行组织形态学观察。6.移植成活的卵巢组织及对照组卵巢组织行SP免疫组化染色,观察PCNA及VEGF表达的变化。结果:1.阴道脱落细胞学涂片结果:对照组阴道细胞涂片显示细胞大,为多边型,胞浆稀薄透明,核小固缩,为雌激素作用的表现;去势组术后4—6天开始,阴道细胞涂片显示细胞呈圆形,核大圆形或椭圆形,核浆比增加,为低雌激素水平的表现;移植组1只术后死亡,剩余家兔术后4—6天开始阴道细胞涂片显示低雌激素水平,7只家兔术后10—20天重新恢复雌激素作用的表现,另2只未恢复。2. E2测定结果:移植组7只家兔术后1个月血清E2水平恢复正常,与正常对照组比较,差异无显著性(P>0.05);另2只家兔E2未恢复正常。去势组家兔E2水平明显降低,与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。3. HE染色子宫内膜形态学观察:去势组:子宫内膜上皮细胞由单层柱状细胞组成,腺体数量少,形态萎缩,间质细胞排裂紧密。移植组:E2水平恢复的7只家兔,子宫内膜表层细胞呈锯齿状,由假复层柱状细胞构成,腺体数量多,排列紧密,形态饱满,间质细胞排列疏松,同对照组;另2只E2低水平的家兔子宫内膜同去势组。4.移植组卵巢组织形态学观察:移植组6只阔韧带处找到成活的卵巢组织,外观见移植的卵巢组织被纤维组织及脂肪组织包裹,HE染色镜下可见形态正常的各级卵泡及大量新生血管。5.免疫组化结果:移植组卵巢组织始基及初级卵泡卵母细胞PCNA表达阳性率为78.67%与对照组(77.55%)比较无明显差异(P>0.05),VEGF的表达部位及表达强度与对照组比较也无明显差异(P>0.05)。结论:1.子宫旁阔韧带处血供丰富,内环境接近卵巢生理状态,移植手术操作简便,较适合卵巢组织移植,结合移植术后应用促性腺激素,获得了较高的移植成活率。2.宫旁阔韧带处移植成活的卵巢组织有很好的内分泌功能,能分泌生理剂量的E2,对阴道上皮及子宫内膜均能发挥良好的作用。3.移植成活的卵巢组织卵母细胞有良好的增殖活性,并能很好地分泌VEGF,对维持血管的生成及正常结构有重要意义。