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第一部分Poly I:C、过氧化氢诱导人角膜上皮细胞发生炎症与氧化应激损伤目的:干眼症(DED)是一种多因素导致的泪膜功能障碍,伴随着不同程度的眼表组织损伤。尽管人们对它的病因还没有确切的定论,越来越多的证据支持炎症与氧化应激的假说。本研究拟通过PolyI:C和过氧化氢(H202)诱导体外培养的人角膜上皮细胞(HCECs)的炎症反应和氧化应激(oxidative stress)状态,为进一步探寻干预机制奠定基础。方法:将体外培养的人角膜上皮细胞分为三组,分别为培养基对照组,25 μg/ml PolyI:C刺激组,500μMH202刺激组。应用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞的白细胞介素(interleukin)1β、IL-6和IL-8的mRNA转录水平及蛋白质含量,评估角膜细胞炎症反应水平。通过Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞增殖活性。以乙酰乙酸双氯荧光(DCFH-DA)为探针,多功能酶标仪记录吸光值,检测细胞内活性氧(ROS)水平。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)观察细胞凋亡情况。运用蛋白质印迹试验(Western blot)检测被剪切的凋亡蛋白(cleavedcaspase)3、磷酸化的yH2AX蛋白及线粒体内外细胞色素(cytochrome)c含量的改变,综合检测角膜上皮细胞氧化应激状态。结果:25 μg/mlPolyI:C能够有效激活角膜上皮细胞的炎症反应,IL-1β、IL-6和IL-8三种细胞因子无论是mRNA转录水平还是蛋白质翻译水平,相对培养基对照组均有显著性升高。CCK-8结果显示,5000μMH2O2显著抑制了角膜细胞增殖活性。H202孵育后的角膜细胞内DCFH-DA荧光强度明显升高,且TUNEL绿色荧光阳.性细胞数目较对照组明显增多,提示细胞发生凋亡。蛋白印迹实验可见cleaved caspase-3、磷酸化的yH2AX蛋白含量均显著提高,cytochrome c有从线粒体内向细胞质转移的趋势,进一步验证了氧化应激凋亡通路的激活。结论:25 μg/mlPolyI:C可有效地诱导人角膜上皮细胞的炎症反应,上调促炎细胞因子的表达。500 μMH202能够导致角膜上皮细胞ROS代谢失衡,抑制细胞增殖活性,激活细胞凋亡通路。第二部分日柏醇对Poly I:C与过氧化氢所致人角膜上皮细胞损伤的保护作用目的:在第一部分研究的结果显示,25 μg/ml PolyI:C及500 μMH2O2各自能够高效地诱导HCECs的炎症反应与ROS的代谢失衡。日柏醇(Hinokitiol,HK)是一种萃取自台湾桧木的环庚三烯酚酮相关化合物,近年来的许多研究论证了其在不同领域的广泛的生物保护作用。本部分研究拟探讨HK对第一部分两种细胞病理模型的相关作用。方法:HCECs 经 0 μM、25μM、50 μM、100 μM HK 孵育 24 h 后,采用 CCK-8 检测HK细胞毒性。在25μg/mlPolyI:C刺激前2h,给予不同浓度HK预先孵育,通过RT-qPCR、ELISA观察IL-1β、IL-6和IL-8的转录与翻译水平变化。在500μMH2O2刺激前2h,给予不同浓度HK预先孵育,通过CCK-8观察不同时间点HCECs增殖活性改变。运用DCFH-DA荧光探针、TUNEL法,检测100 μMHK干预对于氧化应激时细胞ROS含量及细胞凋亡的影响。并采用Western blot检测磷酸化yH2AX、cleaved caspase-3、cytochrome c等凋亡相关蛋白改变,综合评估HK在炎症与氧化损伤模型中的作用。结果:25-100 μMHK对HCECs与培养基对照组相比均没有显著的细胞毒性。经HK预处理2h后,相对于溶剂对照组,IL-1β、IL-6和IL-8的转录与翻译均有所降低,随着HK浓度增加,效果越明显。不同浓度的HK在不同时间点,对于H2O2造成的细胞增值能力降低,有不同程度的恢复作用。100 μMHK能够显著抑制ROS积累,减少凋亡细胞的数目。并且降低磷酸化的γH2AX与激活的caspase-3的含量,阻止cytochrome c从线粒体向细胞质转位。结论:HK能够有效地干预PolyI:C和过氧化氢造成的HCECs炎症与氧化应激损伤,降低促炎细胞因子释放,抑制ROS积累,下调细胞凋亡通路的激活程度。可能具有保护角膜上皮细胞,成为新型干眼症干预措施的潜能。第三部分日柏醇对人角膜上皮细胞损伤保护作用的机制目的:在前期实验中,已成功地建立人角膜上皮细胞炎症反应与氧化应激的模型,并发现日柏醇(HK)能够有效地干预PolyI:C和过氧化氢造成的HCECs炎症与氧化应激损伤,降低促炎细胞因子释放,抑制ROS积累,下调细胞凋亡通路的激活程度。本研究拟探寻HK保护作用的可能机制。方法:HCECs在25μg/ml PolyI:C刺激前2 h,给予100 μM HK预孵,24 h后取样行Western blot试验,检测细胞总IκBα及细胞核内外NFκBp65亚基的蛋白含量。HCECs在500 μM PolyI:C刺激前2 h,给予100 μM HK预孵,24 h后取样,检测丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,及细胞总抗氧化力(T-AOC),并通过Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白含量变化。结果:100μμMHK预孵,可以维持细胞内IκBα蛋白水平,阻滞p65蛋白从细胞质向细胞核转位。且通过抑制MDA生成,恢复SOD、CAT活性,提高T-AOC,缓解细胞氧化应激状态,维持Bcl-2/Bax相对含量,降低凋亡通路的激活。结论:HK可能通过抑制NFκB通路活化,抑制炎症反应;缓解氧化应激压力,稳定Bcl-2/Bax相对含量,减少细胞凋亡。