研究背景与目的宫颈癌是严重威胁女性健康的一种疾病,全世界每年约有50万的新发宫颈癌患者,每年约有20多万女性死于宫颈癌。我国每年新发现的病例为13.15万,发病率占我国妇女生殖系恶性肿瘤的首位。治疗原则主要是以手术治疗为主,辅以化疗和放疗。化疗耐药是导致治疗效果不佳的一大原因,研究发现在宫颈癌的化疗中,至少80%的患者最终出现耐药,甚至是多药耐药(MDR multidrug resistance),导致复发,晚期病人的5年生存率仅为20%左右。放射治疗是宫颈癌的主要治疗手段之一,但临床上存在一部分患者接受放射治疗后效果不佳,主要原因与肿瘤内存在乏氧细胞有关。肿瘤乏氧在实体肿瘤中是一个常见的现象。实体肿瘤中乏氧细胞约占总细胞数的10%-50%,对放射治疗有明显的抵抗,这些乏氧的肿瘤细胞成为化、放疗后复发及转移的潜在根源。因此探讨耐药机制、增强放疗效果是当今肿瘤治疗研究中的热点问题。乏氧是人类和动物肿瘤的共同特征,实体肿瘤的氧分压(PaO2)低于肿瘤起源的正常组织,是随着瘤体增大和血供不充足所形成的重要生存微环境。为了适应乏氧,增加氧的利用和减少氧的消耗,处于快速增殖的肿瘤细胞很多基因的转录活性发生改变,研究已经发现乏氧在肿瘤的发展、恶性侵袭、远处转移、乃至肿瘤对放疗、光动力学治疗和化疗抵抗等方面都起着极其重要的作用。现在发现乏氧激活的核转录因子：乏氧诱导因子-lα(hypoxia inducible factor la, HIF-la)是维持氧稳态,调节机体或细胞适应整体或局部乏氧、介导细胞生存的关键调控因子,几乎调控了乏氧所诱导的所有基因的转录。有报道宫颈癌组织较腺瘤和正常组织乏氧诱导因子-lαmRNA和蛋白水平的表达明显增高,我们认为乏氧诱导因子-1α、和乏氧可能是导致宫颈癌化、放疗敏感性下降和耐药的重要因素,但有关乏氧、乏氧诱导因子-1α和宫颈癌化、放疗之间的系统研究尚未见报道。本研究以人宫颈癌细胞株HeLa为研究对象,检测常氧和乏氧条件下,HeLa细胞化、放疗敏感性的变化和乏氧诱导因子-1αmRNA、蛋白的表达水平变化,及L-OHP的放疗增敏作用；构建SiHIF-1α.质粒表达载体pSIHIF-1αREN以阻断乏氧诱导因子-1α的表达和功能,从乏氧和L-OHP对细胞周期调控、化、放疗诱导细胞凋亡的改变,探讨乏氧诱导因子-1α、L-OHP的作用,对阐明宫颈癌细胞化、放疗耐受可能机制、筛选放疗增敏剂和锚定以乏氧诱导因子-1α作为肿瘤治疗的新靶点提供实验依据。第一部分乏氧对HeLa细胞放化疗敏感性的影响1.目的乏氧作为实体肿瘤生存的重要微环境因素,有报道乏氧能保护肿瘤细胞,降低对化疗药物的敏感性,本文拟探讨乏氧能否降低体外培养的HeLa细胞对L-OHP、放疗敏感性。2.方法胰酶消化收集HeLa细胞接种96孔培养板,每孔1x105个细胞,分成常氧组(含21%02,5%C02和74%N2的细胞培养箱)和乏氧组(1%02,5%C02,94%N2的乏氧细胞培养箱),分别加入L-OHP的浓度为0、2、4、8、16、32、64、128μmol/L,作用24h后行放疗,放疗条件：6MV射线,源皮距(SDD)为97.5cm,放射面积10cm×10cm,放射剂量DT(2Gy),每一浓度设6个复孔,完全培养液和磷酸盐缓冲液(PBS)分别作空白对照和阴性对照。药物放疗作用后24h行MTT检测。并筛选出C1o时L-OHP的浓度(实验浓度)。3.结果3.1 MTT结果显示,不同浓度的L-OHP作用于乏氧和正常状态下的Hela细胞,均表现出增殖抑制作用,并随着L-OHP浓度呈梯度增加；常氧培养下的细胞增殖率低于乏氧状态下的Hela细胞,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)；在同一浓度L-OHP作用下,常氧培养的细胞抑制率明显高于乏氧培养细胞的抑制率(P<0.05)。3.2 MTT结果显示,细胞生长抑制率与放射剂量呈正相关,L-OHP可增加正常和乏氧状态下的Hela细胞对放射线的敏感性,且两者相比差异无统计学意义(P>0.05)。C10时L-OHP的浓度(实验浓度)为4μmol/L。4.结论乏氧培养的HeLa细胞较常氧培养的细胞对放疗、L-OHP的药物敏感性明显下降,显示了乏氧对HeLa细胞的保护性,推测乏氧可能是导致HeLa细胞对化、放疗敏感性下降的重要原因。第二部分HIF-1α介导乏氧状态下HeLa细胞放化疗敏感性中的作用1.目的检测常氧和乏氧培养时HeLa细胞中乏氧诱导因子-1α的表达,包括mRNA水平、蛋白水平检测,并构建SiHIF-1αRNA的表达载体即pSiHIF-1αREN阻断HIF-la的表达和功能并进行相应的检测。2.方法HeLa细胞分为常氧组,乏氧组；常氧+L-OHP:乏氧+L-OHP:常氧+L-OHP +SiHIF.1α组；乏氧+L-OHP+SiHIF.1α组及上述加放疗组。采用RT-PCR检测各组细胞乏氧诱导因子-1amRNA表达水平；免疫细胞化学检测各组细胞乏氧诱导因子-1a的定位表达；Westen bl0t对乏氧诱导因子-1α蛋白进行半定量检测；构建SiHIF-1αRNA的表达载体pSIHIF-1αREN以阻断乏氧诱导因子-1α的表达和功能。3.结果3.1乏氧诱导因子-1amRNA表达的检测采用RT-PCR方法检测各组细胞乏氧诱导因子-1amRNA的表达水平。乏氧较常氧能明显增加HeLa细胞乏氧诱导因子-lamRNA的表达水平(P<0.05)；转染pSIHIF-laREN能明显降低乏氧诱导因子-1amRNA表达水平(P<0.05)；L-OHP对乏氧诱导因子-1αmRNA表达没有明显影响(P>0.05),放疗可调高乏氧诱导因子-1amRNA表达(P<0.05)。3.2免疫细胞化学检测乏氧诱导因子-1α表达收集常氧和乏氧培养24h后HeLa细胞和pSIHIF-laREN细胞爬片以免疫细胞化学染色观察乏氧诱导因子-1α的定位表达。发现乏氧培养后乏氧诱导因子-1α主要表达位于细胞核,而常氧培养时乏氧诱导因子-1α仅在细胞浆有微弱表达；pSIHIF-laREN阻断乏氧诱导因子-1α后其表达明显减弱。3.3采用Western blot方法检测各组细胞乏氧诱导因子-1α蛋白表达水平HeLa细胞在乏氧较常氧乏氧诱导因子-1α蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)；转染pSIHIF-laREN能明显降低乏氧诱导因子-1a蛋白表达水平(P<0.05); L-OHP对乏氧诱导因子-1a蛋白表达没有明显影响(P>0.05),放疗可调高乏氧诱导因子-1α蛋白表达(P>0.05)。4.结论4.1乏氧能明显诱导HeLa细胞乏氧诱导因子-1amRNA、蛋白的表达。4.2构建的SiHIF-laRNA表达质粒pSIHIF-laREN-DNR-DsRedExpress能有效地抑制乏氧诱导因子-1amRNA、蛋白表达水平。4.3放疗可以调高HeLa细胞乏氧诱导因子-1amRNA、蛋白的表达。第三部分HIF-1α及奥沙利铂对增强放化疗敏感性作用机制研究1.目的探讨乏氧诱导因子-1α在乏氧引起HeLa细胞化、放疗敏感性降低和L-OHP放疗增敏中的可能机制：乏氧对HeLa细胞细胞周期的调控；乏氧对L-OHP诱导细胞凋亡的作用；L-OHP放疗增敏作用。2.方法2.1 HeLa细胞分为常氧组(含21%02,5%C02和74%N2)和乏氧培养组(1%02,5%C02,94%N2),转染pSIHIF-laREN以阻断乏氧诱导因子-1α的功能,采用流式细胞术分析各组细胞DNA含量和细胞周期的分布。2.2 HeLa细胞分组：常氧培养；乏氧培养；常氧培养＋放疗；乏氧培养＋放疗；乏氧培养+pSIHIF-1αREN;乏氧培养+pSIHIF-1αREN+L-OHP及相对应加放疗组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡。3.结果3.1.乏氧诱导因子-1α在乏氧诱导细胞周期阻滞中的作用乏氧培养能明显诱导人HeLa细胞阻滞在Go／G1期,常氧培养时Go／G1期细胞含量相比,差异具有显著性意义(P<0.05)；转染pSIHIF-1αREN的乏氧细胞Go／G1期分布与未转染的乏氧细胞之间差异有显著性意义(P<0.05)。3.2乏氧诱导因子-1α在乏氧影响化疗药物诱导细胞凋亡中的作用在L-OHP作用下,常氧组HeLa细胞细胞凋亡率明显高于乏氧细胞组(P<0.05)；乏氧细胞转染pSIHIF-1αREN阻断乏氧诱导因子-1α后细胞凋亡率明显增加(P<0.05),而常氧组细胞转染pSIHIF-1αREN细胞凋亡率无明显改变(P>0.05)。3.3 L-OHP及乏氧诱导因子-1α在乏氧影响放疗中的作用L-OHP培养能明显诱导HeLa细胞阻滞在G2／M期；经L-OHP作用后接受放疗的HeLa细胞细胞凋亡率明显高于其对照组；在接受放疗的HeLa细胞中乏氧细胞转染pSIHIF-laREN阻断乏氧诱导因子-1α后细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。4.结论4.1乏氧能诱导HeLa细胞阻滞在G0／G1期,其中乏氧诱导因子-1α可能发挥重要的调控作用。4.2乏氧促使HeLa细胞抵抗L-OHP和放疗诱导的细胞凋亡,乏氧诱导因子-1α可能发挥了重要的抗凋亡作用。4.3HeLa细胞在L-OHP的作用下细胞周期阻滞在G2／M期,增强放疗效果。