背景膀胱癌(Bladder cancer,BC)是泌尿系统中易发的首位肿瘤,具有较高的发病率和致死率。目前治疗措施主要有腔内膀胱肿瘤切除,根治性膀胱切除等手术、适形放疗和局部灌注或全身化疗等,但是经上述种种措施单独或合并治疗后复查时还经常出现肿瘤再发甚至转移,预后不良。临床数据分析显示自2007年至2012年共有来自我们国家44个大型泌尿外科中心共14260例膀胱癌患者,其中约70%以上的患者接收治疗后出现再发转移扩散,30%的再发肿瘤恶性度较前增加。随着分子靶向治疗在肿瘤综合治疗中逐渐成为临床热点,膀胱癌中有无合适的分子靶点以及如何利用该靶点来减缓肿瘤的再发和进展将具有肯定的现实性意义。脂类组学的研究发现鞘脂也可以具有信号调控的作用。如神经酰胺(Ceramide,Cer)、鞘氨醇(Sphingosine,Sph),可以调控细胞内信号通路引起细胞周期阻滞和促进细胞凋亡;鞘氨醇1-磷酸(Sphingosine 1-phosphate,S1P)则有促进细胞增殖的功能。Cer/Sph与S1P在细胞中的水平存在动态平衡,而它们的作用一种促死与一种促生,正好相反,水平的平衡决定了作用的平衡,作用的平衡决定了该细胞的命运是活或死。这种现象就是所谓的“鞘脂可调变阻器”(Sphingolipid-rheostat function)。研究认为鞘氨醇激酶族(Sphingosine kinases,SphKs)是调控这个平衡的最重要酶族,它能将促死的鞘氨醇、神经酰胺转化为促生的磷酸鞘氨醇。通过抑制此族蛋白的活性则能将可调变阻器调向细胞的死亡方向起到抗肿瘤的作用。发现Sph K1可作为治疗肿瘤的手段。肿瘤细胞侵袭与转移是影响肿瘤患者预后的重要原因。膀胱尿路上皮癌细胞的转移需要历经癌细胞-基底细胞黏附、细胞-基质黏附的破坏,细胞外介质蛋白的水解,以及新生血管生成的一系列过程,抗肿瘤研究就是要研究如何阻断这一系列过程,进而阻断癌细胞的转移,侵袭及扩散,同样是膀胱癌防治工作的重点。我们已知癌细胞侵袭、迁移的过程中,基质金属蛋白酶家族(Matrix-metalloproteinase,MMPs)的降解既是肿瘤侵袭与癌细胞迁移中组织重构所必需的,也是肿瘤侵袭早期的变化之一。恶变细胞通过游离的MMPs发挥降解细胞外基质、促新生血管形成的双重作用而利于其侵袭。基质金属蛋白酶家族中的成员MMP-2与MMP-9能够降解Ⅳ型胶原蛋白进而促进基质膜的降解。在多种肿瘤细胞的侵袭与转移过程中它们的表达都出现升高,两种现象具有相关性。细胞外反应激酶(extracellularresponsekinases,erk)是mapk蛋白家族中的一种蛋白,有酶活性,其生物学作用是能够控制细胞增殖和分化、调控细胞凋亡、决定细胞恶性变,并且能够维持细胞形态。erk的表达升高及激活状态上调可以在许多的人类恶性肿瘤中检测到。p-erk1/2是erk1/2的活化形式,通过erk1/2的202位l-苏氨酸(l-threonine,thr202)与204位酪氨酸(tyrosine,tyr204)出现磷酸化具有活性,作用较erk1/2增强。文献复习发现在许多肿瘤中sphk1/s1p激活erk1/2通路从而促进癌细胞侵袭与迁移。尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物(urokinase-typeplasminogenactivator,upa)能够将血浆纤维蛋白溶酶原活化为酶并能够独立地或者通过活化的酶降解细胞外基质类物质、激活mmps、引起促肿瘤因子以及vegf的释放促进细胞侵袭性增强,并能加速肿瘤细胞的迁移能力。既往研究发现通过抑制erk1/2通路,经过一系列信号转导、放大、反馈等方式,可出现mmp-2/9、upa表达的下调,它们协同起来可以实现抑制肿瘤转移的目的。本研究即以sphk1作为对象,明确sphk1在bc患者中表达是否存在异常,其水平与临床病理特点及疾病预后是否关联,并将探讨其细胞水平及分子水平的机制。具体方式为应用调控sphk1蛋白表达的化学药物作用于膀胱癌肿瘤细胞biu-87,观察膀胱肿瘤细胞biu-87被药物处理后的侵袭和迁移能力的变化,并测定细胞内erk1/2与perk1/2蛋白,mmp-2、mmp-9、upa及vegf蛋白分泌的变化,从细胞及分子水平明确鞘氨醇激酶1有无改变人膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力的作用,其作用是增强还是减弱,进而与临床病理结果相对应,为以鞘氨醇激酶1为靶点的分子肿瘤治疗学初步言明机制。研究目的探讨sphk1在膀胱尿路上皮癌发生发展中的作用及其机制,为将sphk1作为膀胱尿路上皮癌的诊断治疗之分子靶点提供理论依据。材料、方法和结果以细胞及其中分子为研究对象用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol12-myristate13-acetate,pma)为sphk1激活剂;二甲基鞘氨醇(n-dimethyld-erythrosphingsine,dms)为sphk1抑制剂;0.9%nacl为空白试剂将膀胱癌biu-87细胞株分别处理为激活组、抑制组和空白对照组。cck-8法测各组细胞的增殖情况;Transwell小室模型测定各组BIU-87细胞的相对侵袭率与迁移率变化;Western-blot法测各组细胞Sphk1、ERK1/2与p-ERK1/2蛋白水平;ELISA方法检测各组细胞上清中MMP-2、MMP-9、VEGF及uPA的蛋白含量的表达;qRT-PCR测各组细胞Sph K1、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA水平;Matrigel三维培养法观察各组细胞血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成能力。结果:SphK1激活剂可促进BIU-87细胞侵袭与迁移,同时明显增强细胞Sph K1、ERK1/2与p-ERK1/2的蛋白表达,并促进MMP-2、MMP-9及u PA的蛋白分泌。促进Matrigel构建的三维培养系统中VM的形成;明显增强VEGF蛋白表达。Sph K1抑制剂则能抑制BIU-87细胞侵袭与迁移,同时抑制Sph K1、ERK1/2与p-ERK1/2的蛋白表达,并抑制MMP-2、MMP-9及u PA的蛋白分泌;三维培养中不能形成管状VM;明显减弱VEGF蛋白表达。以患者临床资料为研究对象通过q RT-PCR和IHC方法检测患者膀胱癌组织和邻近的正常组织Sphk1的mRNA和蛋白质的表达,研究其差异,并分析其与膀胱癌临床病理特征的关系。结果:在37对膀胱癌组织及临近正常组织中测量发现癌组织中SphK1m RNA的表达显著高于癌旁正常组织中的表达;并发现153例膀胱癌病理组织切片中Sph K1蛋白表达与膀胱癌病理分期(P=0.045)、肿瘤病理分级(P<0.001)显著相关。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线发现高表达Sph K1患者的5年生存率显著下降(P<0.001)。多变量Cox回归分析显示SphK1的高表达可以作为这种疾病的一种独立的不良预后因素。结论Sph K1在膀胱尿路上皮癌发生发展中发挥着重要的作用,其机制可能与激活信号ERK1/2通路从而促进MMP-2、MMP-9及u PA蛋白分泌有关,进而促进VEGF表达并增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力而发挥作用。我们可以将Sph K1作为膀胱尿路上皮癌的诊断治疗之分子靶点。