茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物细菌性青枯病是世界性重大病害。该菌具有较广的寄主范围和地理分布,由青枯菌引起的植物病害造成的经济损失巨大。随着基因工程技术的发展和进步,人类已经能够从基因层面剖析青枯菌的致病机理,开辟出有效控制青枯菌危害的新途径和新方法,为生产上防治青枯菌奠定理论基础。Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)存在于各类细菌中,目前主要集中研究人类和动物致病菌中的Ⅵ型分泌系统,研究发现T6SS与病原菌的致病力、细菌竞争及互作等多种生命活动密切相关。实验室前期研究发现T6SS核心基因参与了青枯菌的致病性。为深入探索T6SS在青枯菌中的功能,本文构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。植物青枯菌基因组中存在两个Ⅰ型信号肽酶,信号肽酶对青枯菌蛋白的分泌起着至关重要的作用,为了更好的研究Ⅰ型信号肽酶在植物病原菌中的作用,探索青枯菌致病的分子机理,本文同时对青枯菌Po82菌株中两个I型信号肽酶基因功能进行了相关研究。1.基因缺失突变株和互补菌株的构建通过生物信息学分析发现,青枯菌Po82菌株中的两个Ⅰ型信号肽酶都有两个保守结构域,其中基因1716编码蛋白具有信号肽和两个跨膜结构域;而Lep B蛋白可能具有跨膜结构域,但不具有信号肽。通过同源重组双交换,构建基因缺失载体和互补载体,并筛选获得T6SS基因簇和Ⅰ型信号肽酶单基因缺失突变株,以及相应的互补菌株。2.T6SS基因簇的功能分析在接种前期,突变株Po82ΔⅥ的致病力明显减弱,后期致病能力逐渐恢复,与野生型菌株相比差异不显著;突变株Po82ΔⅥ的对数期生长速率明显减弱,生物膜形成能力没有明显差异,q RT-PCR分析鞭毛相关基因,突变株Po82ΔⅥ基因flh C、flh D和fnr的表达量明显下调,fli A基因表达量明显上调,运动能力显著增强;q RT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,与野生型菌株相比,差异不显著。虽然T6SS在青枯菌的致病过程中发挥重要作用,但T6SS基因簇的缺失可能不影响Po82菌株的Ⅲ型效应子基因的表达或影响很小。3.Ⅰ型信号肽酶基因的功能分析突变株Po82△1716致病力明显减弱,生长速率、运动能力显著降低;q RT-PCR分析鞭毛及T3SS相关基因表达情况,鞭毛基因flh C、flh D和fnr的表达量明显下调,说明1716基因正向调控鞭毛相关基因的表达;其Ⅲ型标志效应子基因表达量明显下调,说明1716基因影响病原菌Ⅲ型效应子基因的表达,使其致病力下降。而突变株Po82△lep B致病力明显减弱,生长速率、运动能力与野生型菌株相近;q RT-PCR分析鞭毛及T3SS相关基因表达情况,鞭毛相关基因的表达量上调,说明lep B基因负向调控鞭毛相关基因的表达;其Ⅲ型标志效应子pop A、B、C和pop P基因表达量明显上调,说明lep B基因负向调控Ⅲ型效应子基因的表达。