UPL7是一类HECT(Homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus)泛素连接酶,是泛素化途径中一个特异性酶,与植物生长发育密切相关。为了解析UPL7在棉花纤维发育中的功能和作用机制,课题组前期从棉花中克隆了GhUPL7。本文首先分析和鉴定出陆地棉中的HECT基因,并描绘它们的结构特征。试验获得GhUPL7的表达特征以及其上游序列在植物中的表达模式,检测和观察反义抑制转基因植株的胚珠、纤维和叶片表皮毛的变化,从而了解GhUPL7对棉花部分器官生长发育的影响,具体结果如下:1.陆地棉中的HECT基因进化分析根据HECT序列从陆地棉数据库检索出HECT蛋白序列在棉花中的25个同源基因,即HECT基因。25个陆地棉HECT基因与拟南芥UPLs进行进化树分析,可将GhUPLs归类为4个分支,即亚家族I,II,III,IV。其中Gh_A01G1811和Gh_D01G2049两个基因与克隆的GhUPL7基因相似度分别达到99%和98%,且基因Gh_A01G1811和Gh_D01G2049位于亚家族IV,与拟南芥AtUPL7亲缘关系最近。为更好地理解不同HECT基因的结构差异,根据它们的系统发生关系,分别将陆地棉基因组HECT蛋白结构域和HECT序列的外显子-内含子结构进行比较。结果显示:除C端的HECT结构域外,陆地棉HECT基因在N端包含了其他的结构域,推测这些结构域决定HECT蛋白与不同底物相互作用。HECT亚家族IV的N端没有结构域或存在未知结构域。关系密切的HECT基因在基因结构上也更相似,尤其是在外显子和内含子的数量上,主要的不同是它们各自的外显子-内含子长度。以上分析表明GhUPL7确实是HECT类泛素连接酶,并且在进化上具有保守性。2.GhUPL7的表达特征分析设计ghupl7特异性real-timepcr引物,检测ghupl7基因在不同器官的表达水平发现,其在柱头中表达量相对较高,而在其它器官中表达量很低。检测ghupl7基因在纤维不同时期的表达水平发现,纤维快速伸长期的表达量相对较高。3.ghupl7上游序列的克隆及分析克隆ghupl7上游2189bp序列,并运用植物启动子顺式作用元件数据库plantcare对ghupl7基因上游调控序列顺式作用元件数量和种类进行统计和汇总,结果显示存在激素反应相关元件,光反应相关的元件,组织特异性表达的元件、胁迫反应相关元件,结合位点和未知功能元件。可以看出这些顺式作用元件与植物生长发育密切相关。继而构建启动子表达载体,烟草遗传转化,在烟草器官gus染色结果显示:ghupl7启动子指导的gus基因主要在烟草柱头中表达,其次是花托、胚珠表面。进一步检测ghupl7启动子转基因烟草不同组织的gus活性:在柱头中酶活力最强,却仅有76.39nmol/min/mg,而不同时期的花托和子房相对较低,8dpa的花托和子房酶活力分别为11.13nmol/min/mg和10.28nmol/min/mg。以上结果表明ghupl7启动子指导的gus可能在花器官中表达。4.反义抑制ghupl7基因植株的种子增大,子指增加ghupl7是泛素化反应中一个特异性酶,而泛素化反应与植物生长发育息息相关。为探究该基因是否通过泛素化反应参与三大营养物质的代谢途径,构建植物表达载体camv35s::antisenseghupl7转入陆地棉(冀棉14)中,并通过设计rt引物进行real-timepcr筛选获得反义抑制ghupl7的转基因植株。收获繁殖继续筛选出t1代6个转化子共42株植株,对10dpa胚珠的总氮和可溶性总糖含量进行测定。结果显示:总氮含量最高增加26.60%;可溶性总糖含量最高增加32.96%。与之对应胚珠最后形成的种子增大,这与upl7拟南芥突变体表型相一致;产量性状统计发现:子指增加最高达14.86%。推测ghupl7可能参与泛素蛋白酶体途径,影响碳氮代谢。5.反义抑制ghupl7基因植株短绒增加,衣分无明显变化纤维的营养由胚珠供给,欲知反义抑制ghupl7对纤维发育的影响,对反义抑制ghupl7植株t1代进行纤维起始观察、糖含量测定、成熟纤维表型观察、产量性状统计。电镜观察反义抑制ghupl7基因对棉花纤维起始的影响,结果显示纤维细胞起始出现异常纤维,但纤维的突起数量却无明显变化。糖含量测定显示反义抑制ghupl7植株纤维可溶性总糖最高降低了30.66%;成熟纤维观察结果显示反义抑制ghupl7棉花长纤维不变或略变少,短绒增多。产量性状统计结果表明衣分变化不显著,最高降低了7.16%。6.反义抑制GhUPL7基因增加棉花叶片表皮毛的分支有研究报道UPLs家族的UPL3在拟南芥中与表皮毛的发育有关,故而对同为HECT家族的GhUPL7反义抑制植株叶片表皮毛进行观察,并对其分支数进行统计,结果显示1-3个分支的百分比明显减少,大于4个分支的百分比明显增多。该结果与upl7拟南芥突变体表皮毛分支数表型一致。反义抑制GhUPL7基因增加棉花叶片表皮毛的分支,推测表皮毛与纤维短绒发育具有相似机制。