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重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)是人类的一种由针对神经肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体(Acetylcholine Receptor,N2-AChR)的自身抗体介导的器官特异自身免疫疾病,临床主要特征是随意肌进行性虚弱无。实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis,EAMG)是用从电鳐电器官提取的乙酰胆碱受体加完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)免疫敏感动物后制成的人类重症肌无力模型。MG 体内 N2-AchRab 的产生主要依赖于 Th 细胞及其分泌的细胞因子的调控,Th1细胞因子 IFN-γ、IL-2 以及 Th2细胞因子 IL-4、IL-10 与 MG 和 EAMG 发生发展相关。Th3细胞因子 TGF-β则对这种疾病有抑制作用。 重肌灵片为河北以岭医药研究院临床长期用于治疗重症肌无力的中药复方,其主要组成为黄芪、人参、鹿茸、制马钱子等,具有温理奇阳,扶元振颓作用,临床治疗千余例肌无力患者,效果明显。药效学研究提示重肌灵片具有免疫调节作用。为探讨重肌灵片免疫调节作用的机理,我们用纯化的 N2-AchR 作为抗原免疫 Lewis 大鼠,展开了以细胞因子尤其是 IFN-γ为中心相关研究。 本课题分四部分进行: 1. 重肌灵片治疗给药对 EAMG 大鼠的主要药理作用 我们用从电鳐电器官提取的含 N2-AchR 粗提液加完全弗氏佐剂免疫 150-180gLewis 大鼠制成 EAMG, 动物于首次免疫后的第 25 天开始给药,对 EAMG 大鼠的临床症状、肌力、运动能力、肌电图、血清中抗 N2-AchRab、突触后膜 N2-AchR 的数目以及细胞免疫功能等指标进行观察。结果发现重肌灵片可以改善 EAMG 模型大鼠的临床症状,提高 EAMG 模型大鼠体重、肌力和运动能力,抑制 EAMG 模型大鼠血清中抗 N2-AchRab,降低 EAMG 模型大鼠连续低频电刺激后出现的肌肉收缩幅度的衰减,提高 EAMG 模型大鼠突触后膜 N2-AchR 数目。抑制 EAMG 模型大鼠体内 N2-AchR诱导的特异性细胞免疫反应,对 ConA 诱导的细胞免疫反应有增强作用(P<0.01或 P<0.05)。重肌灵药理作用不同于西药的免疫抑制剂,具有选择性免疫调节作用,即下调针对 N2-AchR 特异性病理免疫性反应,对正常免疫功能不抑制反而有增强作用。 2. 重肌灵对正常小鼠和免疫抑制小鼠免疫功能的影响 我们选用 18-22g C57BL/6j 雌性小鼠,灌胃给药 10 日后发现,重肌灵大、中剂量组对正常小鼠脾脏、胸腺重量无明显影响。重肌灵大剂量能明显增强 ConA 和LPS 诱导的小鼠脾 T、B 淋巴细胞增殖和 IL-2 的分泌; 选用 18-22g C57BL/6j雌性小鼠环磷酰胺隔日腹腔注射,给药剂量为 80mg/Kg,共三次,制备免疫抑制模型结果发现重肌灵能显著提高免疫抑制小鼠胸腺及脾脏<WP=5>2 重肌灵片抗重症肌无力作用机理研究指数,增强 ConA、LPS 诱导的 T、B 细胞增殖,提高 IL-2 的分泌量,且有明显的量效关系。说明重肌灵具有免疫增强剂特性。 3. N2-AchR 的纯化和建立纯化 N2-AchR 诱导的 EAMG 模型 我们将含 N2-AchR 的 TritonX-100 粗提液用α-眼镜蛇毒偶联的琼脂糖亲和层析柱进一步纯化,纯化的 N2-AchR 经过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳呈 4 个条带,其分子量分别为 40,000、43,000、53,000、62,000。这可能是受体的四个亚基。采用考马斯亮兰 G250法测定纯化 N2-AchR的蛋白量为 116.6mg/5.2公斤电鳐湿器官。 我们参考国外文献,以 150 ug 国产电鳐纯化的 N2-AchR,每隔 10 天免疫 Lewis大鼠,共三次,成功诱导 EAMG 模型。纯化 N2-AchR 诱导的 EAMG 模型发病早、病情重、模型发生率高(>70%)。 4. 重肌灵片对纯化 N2-AchR 诱导的 EAMG 大鼠免疫调节机制的研究 采用双抗体夹心 ABC-ELISA 和 RT-PCR 法对纯化 N2-AChR 诱导的 EAMG 大鼠体内 IFN-γ、IL-4、 TGF-β的含量和 mRNA 转录水平进行检测。研究发现重肌灵片通过上调 EAMG 大鼠体内内源性抑制因子 TGF-βmRNA 的转录来增加 TGF-β蛋白合成,大量分泌的 TGF-β作用于 IFN-γ、IL-4 从而抑制后两种因子的异常增高。结果导致抗 N2-AchRab 滴度下降,达到抗肌无力作用。 采用硝酸还原酶法和化学比色法检测纯化 N2-AChR 诱导的 EAMG 大鼠体内 NO和 NOS 的含量。结果发现重肌灵片能抑制病理性 NOS 和 NO 产生,减轻其对肌肉神经组织的损伤。 将纯化N2-AChR诱导的EAMG大鼠 窝、腹股沟淋巴结细胞体外培养,用N2-AchR刺激 24 小时后,上流式细胞仪检测不同亚群特异性 T 细胞的凋亡率。研究发现重肌灵片能显著提高特异性 CD4+T 细胞的凋亡,恢复 EAMG 体内淋巴细胞的自稳状态,达到抗肌无力的目的。重肌灵片这种促进自身反应性 T 细胞凋亡的作用,不能被IFN-γ逆转。 综合以上研究结果表明,EAMG 体内存在 IFN-γ、IL-4 表达异常增多现象,二者作用于 B 细胞刺激其合成大量抗 AchRIgG1 和 IgG2,这种自身抗体作用于 NMJ处的乙酰胆碱受体,致使神经肌肉传导障碍从而诱发肌无力症状的产生。重肌灵具有免疫调节作用:通过上调 EAMG 体内内源性抑制因子 TGF-βmRNA 转录来增加TGF-β蛋白合成,大量分泌的 TGF-β下调异常增多致病因子---IFN-γ、IL-4,结果 EAMG 大鼠体