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寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,引起了部分关注;但直到2015年南美洲ZIKV疫情爆发,才受到了国际社会的广泛关注。基于该病毒对全球公共卫生安全造成的重大威胁,2016年ZIKV感染被正式列为全球公共卫生紧急事件,针对它的研究也不断深入。ZIKV表面覆盖包膜,内部核衣壳组成二十面体结构,其基因组为大小约11kb的正义单链RNA。被ZIKV感染后,患者症状一般较轻,包括发热、斑疹、关节痛和结膜炎等,也有研究发现,它与神经系统疾病(如格林-巴利综合征)存在必要关联;更严重的是,先天性ZIKV感染可能导致严重的临床疾病,包括骨骼异常、眼睛视觉病变、小头畸形、脑积水等。ZIKV可能存在的垂直传播、性传播、血液传播等诸多传播途径,也导致ZIKV的防治更为艰难,更易造成严重的公共卫生危机。在ZIKV引起了国际社会的广泛关注后,其疫苗研发也进入了“快车道”。目前,正在研发的ZIKV疫苗种类主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。而这些正在研发的疫苗都专注于诱导中和性抗体的产生,抗体能够通过中和病毒颗粒近而抑制病毒的复制,但所产生的抗体虽然可能有保护性,但也可能导致病毒感染过程中的抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)反应的发生。有实验证据显示,ZIKV的抗体能够在体外实验模型中协助登革病毒增强对机体或细胞的感染(ADE),反之亦然。有报道发现ZIKV感染过程中的T细胞反应发挥着重要作用,ZIKV的记忆性CD4+和CD8+T细胞反应在动物模型中被证实具有针对ZIKV的保护作用,而T细胞反应本身没有ADE发生的可能性。本课题通过开发具有保护性,且无ADE风险的T细胞疫苗,研究T细胞疫苗预防病毒感染的可行性以及有效性,进而探究T细胞反应在ZIKV感染过程中所发挥的作用,以及T细胞疫苗在ZIKV感染过程中提供保护作用的机制。ZIKV T细胞表位的确定对T细胞疫苗及T细胞免疫研究有重要作用,因此本课题首先着重于在ZIKV感染小鼠中T细胞表位的确定。我们针对ZIKV的蛋白序列,设计并合成了427条重叠多肽,每条为18个氨基酸长,相邻多肽间重叠10个氨基酸,覆盖病毒蛋白序列全长。利用IFN-γELISPOT试剂盒,我们检测出了63条阳性肽段。通过FACS进一步分析不同T细胞亚群被ZIKV肽段刺激起的细胞因子分泌量,最终确定了11条包含CD4+T细胞表位的肽段,以及19条包含CD8+T细胞表位的肽段。其中7条肽段位于结构蛋白上,21条肽段位于非结构蛋白上。为了聚焦T细胞疫苗、避免抗体反应的干扰,我们利用从非结构蛋白中选择的包含T细胞表位的肽段构建了3种ZIKV T细胞疫苗,包括仅含CD4+T细胞表位的肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)。仅含CD8+T细胞表位的肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101),以及包含CD4+T细胞表位肽段NS2A(95-112),NS2B(13-30),NS2B(37-54),NS2B(93-110),NS3(43-60)与包含CD8+T细胞表位肽段NS1(263-280),NS4A(66-83),NS4B(36-53),NS4B(76-93),NS4B(84-101)的混合。然后我们通过ZIKV感染免疫后的小鼠以验证三种ZIKV T细胞疫苗的保护效果,发现三种ZIKV T细胞疫苗都能给被感染的小鼠提供保护,且同时包含CD4+与CD8+T细胞表位肽段疫苗能提供最佳保护。我们也同时发现ZIKV T细胞疫苗对于清除眼睛、脾脏、肝脏组织内的病毒有很好的效果。通过中和实验、ADE实验,我们确认利用这些T细胞表位肽段进行多次免疫后,在急性感染期既没有中和性抗体的产生,也没有ADE。在进一步的体内杀伤试验中,发现接种了这三种肽段疫苗的小鼠体内均可杀伤用相应肽段共孵育过的靶细胞。同时接种包含CD4+和CD8+T细胞表位肽段疫苗的小鼠表现出最佳的体内杀伤率,达到40.6%的特异性杀伤率。而那些单独使用CD4+或CD8+T细胞表位疫苗免疫的小鼠则分别有24.5%或19.1%的特异性T细胞杀伤率。这些数据表明,由T细胞表位疫苗产生的保护作用,部分是由T细胞介导的细胞毒作用。并且这种保护作用不依赖中和抗体,所以没有诱导ADE的风险。因此,T细胞表位具有开发前景。我们也尝试T细胞疫苗与传统抗体疫苗的组合以提供更好的疫苗功效。尤其是在黄病毒疫苗领域,通过增强保护性的T细胞免疫可以抑制体内ADE的风险,是个值得探讨的问题。在这里,我们设计了ZIKV T细胞肽段疫苗和E80蛋白疫苗的组合免疫方案,我们发现联合免疫后的小鼠在感染后的第3天,所有疫苗接种组的病毒血症水平均显著降低至检测阈值(25 PFU/ml)。但是,在仅用E80免疫的小鼠中,血液中所检测到的病毒RNA(包括血液中细胞内的病毒RNA)却并未显著降低。相反,用CD4+或CD8+T细胞疫苗免疫的小鼠血液中的病毒RNA明显降低。在感染后第7天同样观察到了这种差异。这些数据提示CD4+或CD8+T细胞疫苗的加入能够提高E80蛋白疫苗的功效。综上,本次研究首先证实了ZIKV感染在小鼠中可以引起强烈而广泛的T细胞应答,并鉴定出一系列新颖的CD4+和CD8+T细胞表位,且发现其中一些表位可以激活细胞毒性T细胞作用。随后,使用这些新鉴定的带有免疫优势表位的肽段,我们开发出一种新型ZIKV T细胞备选疫苗,证明该疫苗可赋予接种疫苗的小鼠抗ZIKV感染的能力。我们也发现与单独接种任何一种疫苗相比,T细胞表位疫苗和E80重组蛋白疫苗的联合使用可以提供更好的保护。这些结果将为开发基于CD4+和CD8+T细胞表位的ZIKV T细胞疫苗提供理论基础和先导产品。并且该发现也有助于打破其他病毒的T细胞疫苗研发的固有思路,具有重要的借鉴意义。