论文部分内容阅读
研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)属于临床上常见的骨代谢疾病,以骨密度降低、骨量减少及骨小梁结构紊乱等为主要特征,对患者的身体健康和正常生活造成严重影响。有效增强成骨细胞活性及增加数量能明显改善骨质疏松症状,研究成骨细胞的成骨分化机制,可以为骨质疏松的治疗提供新的思路。近年来,miRNA与骨代谢的关系备受关注,目前已经发现了一些特异性miRNA及其作用靶点在成骨分化过程中起着重要作用,miRNA在成骨分化中作用机制的深入研究,将有助于为骨类疾病的治疗提供新的理论。本研究通过探究miR-877-3p在MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用及调节机制,为骨形成障碍疾病提供了一种潜在的治疗方法。实验方法1、miR-877-3p对TGF-β1诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化的影响(1)用含TGF-β1的培养基诱导MC3T3-E1,qRT-PCR检测诱导后miR-877-3p、RUNX2、COL1A1 和 OSX 的表达水平,Western Blotting 检测 RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,碱性磷酸酶活性检测。(2)分别转染miR-877-3p mimics或inhibitor,qRT-PCR验证转染效率,并检测RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,转染后的细胞进行成骨分化诱导,碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察矿化结节的形成。(3)体内实验验证miR-877-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用2、miR-877-3p调控Smad7在MC3T3-E1成骨分化过程中表达的研究(1)利用生物信息学预测miR-877-3p的下游靶基因,双荧光素酶报告实验进行验证。(2)用含 TGF-β1 的培养基诱导 MC3T3-E1,qRT-PCR 和 Western Blotting 检测Smad7的表达水平。(3)转染 miR-877-3p mimics 或 inhibitor,qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Smad7的表达水平。(4)MC3T3-E1细胞转染miR-877-3p inhibitor后用含TGF-β1的培养基诱导,qRT-PCR 检测 Smad7、RUNX2、COL1A1 和 OSX 的表达水平。Western Blotting检测RUNX2、Smad7、p-Smad2、t-Smad2、p-Smad3、t-Smad3 的表达。(5)在MC3T3-E1细胞中共转染miR-877-3p mimics和Smad7过表达质粒,并进行成骨分化诱导,qRT-PCR检测Smad7、RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,ALP染色和茜素红染色观察矿化结节的形成。研究结果1、miR-877-3p对TGF-β1诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化的影响(1)TGF-β1能促进MC3T3-E1细胞成骨分化。(2)过表达miR-877-3p促进MC3T3-E1细胞成骨分化;反之,干扰miR-877-3p抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。(3)体内裸鼠实验证实过表达miR-877-3p促进MC3T3-E1细胞成骨分化2、miR-877-3p调控Smad7在MC3T3-E1成骨分化过程中表达的研究(1)Smad7是miR-877-3p的下游靶基因。(2)Smad7在MC3T3-E1细胞成骨分化中低表达。(3)miR-877-3p在MC3T3-E1细胞成骨分化中抑制Smad7的表达。(4)TGF-β1逆转抑制miR-877-3p导致的成骨分化减弱。(5)miR-877-3p通过抑制Smad7来促进MC3T3-E1细胞成骨分化。结论TGF-β1培养基促进MC3T3-E1细胞成骨分化,并增加miR-877-3p的表达,miR-877-3p有促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用。miR-877-3p通过抑制其靶基因Smad7的表达,从而促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。下调Smad7的表达后,能提高MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。