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应激性免疫抑制是家禽生产面临的严重问题之一，常常导致疫苗免疫效果不良或免疫失败等问题，对雏鸡危害尤为明显。miRNA在免疫调控中发挥着重要作用，可以直接或间接地影响免疫相关基因表达活性，参与免疫功能调控。然而，循环miRNA在家禽应激性免疫抑制过程中的分子调控机制仍不明晰。本研究以鸡为模式生物，在正常机体和地塞米松(Dex)诱导的应激性免疫抑制条件下分别进行禽流感病毒(AIV)疫苗免疫雏鸡，在免疫后1天(dpi)、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi、7dpi、14dpi、21dpi、28dpi和35dpi十个时间点分别收集血清、心脏、肝脏、法氏囊、脾、腺胃等组织，利用荧光定量颈环RT-PCR技术分析15种AIV相关的血清循环miRNA表达特性与变化规律，选取出3个显著差异表达循环miRNA，鉴定其组织来源，生物信息学预测其作用机制。研究结果如下：
首先，正常机体条件下雏鸡AIV疫苗免疫后，10个AIV相关的循环miRNA在2dpi、5dpi、21dpi和35dpi显著下调或上调变化；Dex诱导的应激性免疫抑制影响机体循环miRNA过程中，2dpi、5dpi、14dpi和28dpi是循环miRNA显著变化时间点；应激性免疫抑制条件下的AIV疫苗免疫应答过程中，2dpi、5dpi、7dpi、14dpi、21dpi和28dpi是miRNA波动幅度和频率显著变化的时间点。对比分析发现循环miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p具有较好的差异代表性，因此将这三种miRNA用于后续深入研究。
其次，分别鉴定miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p在不同条件下11种组织脏器的表达特性，结果表明三种miRNA在不同组织、条件和时间的表达活性存在显著差异。肺、腺胃、法氏囊、盲肠扁桃体、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响血清循环miR-214和miR-24-3p差异表达的关键组织；腺胃、法氏囊、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响血清循环miR-20a-5p差异表达的主要组织。而在应激性免疫抑制和AIV疫苗免疫应答双重条件下，miRNA的作用机制可能变得更为复杂，表明miRNA在不同条件下的功能和机制可能不同。
最后，通过对miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p进行生物信息学分析，发现miR-214的靶基因主要富集在正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、MAPK等通路，推测可能通过“miR-214-MAP3K3”和“miR-214-PTEN”通路参与免疫调控；miR-24-3p的靶基因也主要调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、MAPK等通路，可能通过“miR-24-3p-RAP1B”和“miR-24-3p-RAP1A”通路参与免疫调控；miR-20a-5p的靶基因主要参与转录调控、自噬、mTOR和ErBb信号等通路中，可能主要通过靶向“miR-20a-5p-AKT3”、“miR-20a-5p-PTEN”和“miR-20a-5p-PIK3R1”等通路参与免疫调控。
本研究通过对AIV相关的血清循环miRNA表达特性进行初探，筛选出应激性免疫抑制影响AIV疫苗免疫应答的差异表达miRNA(miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p)，发现腺胃、法氏囊、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响不同条件下候选血清循环miRNA的关键组织脏器，预测出miRNA参与免疫调控的多条信号通路，可为深入研究应激性免疫抑制影响免疫应答的分子作用机制和开发以循环miRNA为靶标的家禽免疫状态辅助检测技术提供理论和实践参考。
首先，正常机体条件下雏鸡AIV疫苗免疫后，10个AIV相关的循环miRNA在2dpi、5dpi、21dpi和35dpi显著下调或上调变化；Dex诱导的应激性免疫抑制影响机体循环miRNA过程中，2dpi、5dpi、14dpi和28dpi是循环miRNA显著变化时间点；应激性免疫抑制条件下的AIV疫苗免疫应答过程中，2dpi、5dpi、7dpi、14dpi、21dpi和28dpi是miRNA波动幅度和频率显著变化的时间点。对比分析发现循环miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p具有较好的差异代表性，因此将这三种miRNA用于后续深入研究。
其次，分别鉴定miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p在不同条件下11种组织脏器的表达特性，结果表明三种miRNA在不同组织、条件和时间的表达活性存在显著差异。肺、腺胃、法氏囊、盲肠扁桃体、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响血清循环miR-214和miR-24-3p差异表达的关键组织；腺胃、法氏囊、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响血清循环miR-20a-5p差异表达的主要组织。而在应激性免疫抑制和AIV疫苗免疫应答双重条件下，miRNA的作用机制可能变得更为复杂，表明miRNA在不同条件下的功能和机制可能不同。
最后，通过对miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p进行生物信息学分析，发现miR-214的靶基因主要富集在正调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、MAPK等通路，推测可能通过“miR-214-MAP3K3”和“miR-214-PTEN”通路参与免疫调控；miR-24-3p的靶基因也主要调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、MAPK等通路，可能通过“miR-24-3p-RAP1B”和“miR-24-3p-RAP1A”通路参与免疫调控；miR-20a-5p的靶基因主要参与转录调控、自噬、mTOR和ErBb信号等通路中，可能主要通过靶向“miR-20a-5p-AKT3”、“miR-20a-5p-PTEN”和“miR-20a-5p-PIK3R1”等通路参与免疫调控。
本研究通过对AIV相关的血清循环miRNA表达特性进行初探，筛选出应激性免疫抑制影响AIV疫苗免疫应答的差异表达miRNA(miR-214、miR-24-3p和miR-20a-5p)，发现腺胃、法氏囊、胸腺、脾、小肠、结肠等可能是影响不同条件下候选血清循环miRNA的关键组织脏器，预测出miRNA参与免疫调控的多条信号通路，可为深入研究应激性免疫抑制影响免疫应答的分子作用机制和开发以循环miRNA为靶标的家禽免疫状态辅助检测技术提供理论和实践参考。