背景:碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)几乎对所有一线抗生素都耐药,往往引起难以治愈甚至危及生命的感染。高毒力(高黏性)肺炎克雷伯菌可在健康人群中引起严重的感染,如肝脓肿、脑膜炎。碳青霉烯类耐药高黏性肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae,CR-HMKP)的出现和增加可能会导致更严重、更复杂的公共卫生问题。噬菌体(bacteriophage,phage)是一种能够精准、高效地“杀死”细菌的病毒。20世纪20年代,具有高效杀菌活性的噬菌体就被视为潜在的抗菌剂,并被用于治疗感染性疾病。本文中,我们对一株新的噬菌体kpssk3进行了生物学特性的研究和全基因组分析,并通过建立小鼠感染模型评估了它的应用潜力。材料与方法:1、用双层琼脂法从西南医院未消毒的污水中分离能够裂解碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体。2、为了观察噬菌体的形态,用氯化铯梯度离心法浓缩噬菌体,并以2%磷钨酸负染,之后在100 kV电压下用透射电子显微镜观察。3、绘制噬菌体的一步生长曲线,以揭示噬菌体的潜伏期和爆发量。4、用77株临床菌株,综合使用斑点试验和成斑率实验来测定kpssk3的宿主范围。5、为了探究kpssk3在不同条件下的稳定性,我们检测了它在不同温度(4、25、37、45、50、55、60、65和70℃)和pH值(2-11)下的滴度。使用双层琼脂法测定处理后的噬菌体滴度。6、通过改良酚氯仿抽提法提取噬菌体DNA。用Illumina MiSeq平台对DNA进行测序。用GeneMarkS软件预测开放阅读框。用BLASTp和Pfam数据库预测开放阅读框编码蛋白质的功能。将每个开放阅读框与病原菌毒力因子数据库和抗性基因数据库进行比对以验证噬菌体的安全性。通过RNAmmer和tRNAscan-SE分析基因组中是否存在rRNA和tRNA基因。为了揭示kpssk3与其他噬菌体之间的亲缘关系,我们基于主要衣壳蛋白氨基酸序列,用Molecular Evolutionary Genetic Analysis软件构建进化树。7、通过腹腔注射2倍绝对致死量的对数期NY03菌液建立菌血症小鼠模型,3小时后用不同的抗菌剂(噬菌体kpssk3,多粘菌素B,替加环素和头孢他啶/阿维巴坦联合氨曲南)治疗。8、在噬菌体治疗之前(0天)和之后(3天和10天)3个时间点收集噬菌体治疗组小鼠的粪便样品,通过16S rDNA基因高通量测序分析肠道菌群的变化。9、用CCK-8实验检测不同浓度的kpssk3对HeLa细胞的毒性。在动物水平上,每天两次将2种不同剂量的kpssk3注入小鼠腹腔。5天后,对小鼠实施安乐死,收集脾脏、肺、肾、肝进行组织病理学分析。结果:1、从西南医院的污水中分离出一株CRKP的裂解性噬菌体,并命名为kpssk3。2、透射电镜照片显示kpssk3具有对称的头部和短尾,表明kpssk3属于短尾噬菌体科。3、噬菌体kpssk3的潜伏期约为10分钟,爆发量约为200PFU/cell。4、噬菌体kpssk3能够裂解92.59%(25/27)的CRKP临床菌株,而无法裂解其他类菌株。5、在pH值4.0-11.0、温度4-45℃的环境中,噬菌体的滴度维持稳定。6、噬菌体kpssk3基因组为线性dsDNA,全长40539 bp,包含42个开放阅读框,未发现携带耐药基因、毒力基因或编码rRNA、tRNA、整合酶基因。7、单剂量噬菌体治疗可使菌血症小鼠存活率达到100%。抗生素治疗组小鼠的7日存活率分别为(多粘菌素B)20%,(替加环素)20%和(头孢他啶/阿维巴坦联合氨曲南)90%。8、16S rDNA测序分析显示,除Chao1和ACE指数下降外,肠道菌群未见明显变化。9、细胞实验和动物实验均未发现噬菌体有明显的细胞毒性。结论:总之,kpssk3是一个新的裂解性噬菌体,它具有严格的宿主特异性、降解胞外多糖的能力、良好的稳定性和安全的基因组,这些优点使kpssk3具备了控制CRKP感染的基本能力。kpssk3极大提高了用CRKP诱导的菌血症小鼠的存活率。同时,体内实验和体外实验都显示kpssk3没有明显的细胞毒性,而且我们也没有得到治疗过程中小鼠肠道菌群发生显著改变的证据。kpssk3为治疗CRKP菌血症提供了新的有效手段,具有很大的临床应用潜力。