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山东寿光鸡群中的ALV感染较为严重,对其进行了检测,毒株的分离鉴定、基因组特征分析以及多克隆抗体的制备等研究。从该鸡群采集样品,经ALV p27抗原ELISA检测,阳性率为54%。阳性血浆接种DF-1细胞,提细胞基因组cDNA,用ALV特异性引物经PCR扩增env基因,与国内外A、B、C、D、E、J亚群参考株同源性为57.1%~93.2%,其中,与内源性E亚群参考株为93.2%,由于DF-1细胞可以抗内源性病毒,所以可以排除E亚群;与K亚群参考株的核苷酸为94.1%~99.4%,进化树分析显示,10个分离株与K亚群参考株亲缘关系最近,因此,初步确定为ALV-K,分别命名为hz01~hz10。根据遗传关系,选取3个不在同一分支上的分离株,将感染该病毒的鸡解剖后,表观未看到症状,病理组织观察发现,肝脏、脾脏、卵巢、肺脏、肾脏均有不同程度的淋巴细胞浸润和出血,其中心脏最为严重,出现了部分细胞变性坏死;超微结构病理变化为,肝脏和脾脏中出现淋巴细胞核膜褶皱,胞质中含有液泡,见到多个大小为200nm左右的病毒粒子,肝脏中形成淋巴小结。将hz01、hz04、hz06毒株进行全基因组测序,其前病毒cDNA全基因组序列长度分别为7482bp、7491bp、7478bp,与K亚群参考株相比,除R区外,其余基因均有不同程度的增长或缩短。gag、pol、gp37基因及R、U5区与大多参考毒株核苷酸序列同源性都在95%以上,而gp85基因、U3区差异显著。3个分离株的gp85和gp37核苷酸均为1005bp、612bp,编码相应的氨基酸序列大小分别是:335aa、204aa。分离株之间的gp85核苷酸同源性为97.2%~99.0%,氨基酸同源性为95.2%~98.8%;与国内外各个K亚群参考株核苷酸同源性为94.7%~99.4%,氨基酸同源性为91.3%~99.6%,与GDFX0602、GDFX0603的氨基酸同源性最高,与HB2015032、JS11C1同源性最低,虽均为ALV-K,分离株间的gp85氨基酸序列存在较小的差异,而与各个K亚群参考株存在不同程度差异,主要表现在个别位点的突变,没有插入、缺失等变化,这些氨基酸突变可能会使蛋白质结构发生变化。LTR长度分别为276bp、280bp、276bp,与内源性病毒相似,同源性最高为95.3%~98.2%,与外源性病毒较低为58.5%~64.3%。与K亚群相比,其长度差别主要表现在U3区,变异也主要出现在该区,分离株之间的核苷酸同源性为97.2%~98.9%,与国内外参考株同源性为36.4%~100%,从遗传进化树上来看,与HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01亲缘关系最远,变异较大,碱基插入、缺失、突变较多。3个分离株的全基因序列与GDFX0601,GDFX0602和GDFX0603参考株同源性极高,虽从不同地区分离出来的,但可能从同一毒株变异而来,而与HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01的同源性较低,均为不同的进化背景。ALV-K可能已经存在于山东本地鸡群中很长一段时间,具有毒株多样化趋势。因此,加强对ALV-K生物学特性的深入分析,了解不同地区ALV-K的变异差异,将有益于中国本土鸡的ALV根除计划。用ALV-K-gp85特异性引物,经PCR扩增出1002bp大小的ALV-K-gp85基因片段,建立重组质粒pET-32a-ALV-K-gp85,转化到大肠杆菌BL21中,经可溶性分析,该蛋白主要以包涵体的形式存在,用Ni-NTA亲和层析介质对其纯化,进行SDSPAGE和Western分析,出现了1条相对分子量为53kD左右的条带,BCA法测得的蛋白浓度为3.1436ug/uL。纯化后的蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体。经ELISA方法检测,抗体效价达到1:12800,进行IFA检测,制备的多克隆抗体可识别ALV-K感染。为制备亚单位疫苗和建立快速检测方法奠定了基础,为今后防控、净化该病提供可能。综上,分离得到10株ALV-K。hz01、hz04、hz06分离株变异主要表现在gp85基因和U3区上,gag、pol、gp37基因以及U5、R区比较保守。成功表达并纯化了ALVK-gp85蛋白,并得到了其多克隆抗体。