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第一部分HLA-G1抑制人自然杀伤细胞杀伤猪内皮细胞的研究【目的】研究HLA-G1基因抑制人NK细胞系NK92和外周血单个核细胞（hPBMC）对猪血管内皮细胞（PEC）杀伤的作用。【方法】利用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3-HLA-G1质粒转入原代培养的PEC，用流式细胞仪及间接免疫荧光显微镜在蛋白质水平上检测HLA-G1分子在PEC上的表达；以NK细胞系（NK92）和hPBMC为效应细胞，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测转染有HLA-G1基因的PEC对NK92和hPBMC杀伤活性的抵御作用。【结果】利用脂质体转染技术成功将pcDNA3-HLA-G1转入原代培养的PEC；NK92和hPBMC对转染有HLA-G1的PEC的杀伤效率（41.5％±14.0％；45.4％±12.1％）与对照组（75.3％±10.5％；74.6％±11.2％）相比，均有明显降低（P＜0.05）。【结论】HLA-G1分子可以明显抑制NK92细胞以及hPBMC对PEC的杀伤作用。第二部分建立表达可溶性HLA-G1真核细胞系并获取可溶性HLA-G1【目的】为了研究可溶性HLA-G1（sHLA-G1）在抑制NK细胞以及T细胞介导的异种排斥反应中的作用，在本实验中建立表达sHLA-G1的真核细胞系，获取纯化的sHLA-G1蛋白。【方法】利用核转染技术将pcDNA3-sHLA-G1质粒转入LCL721.221细胞；流式细胞仪和荧光显微镜对转染率进行判定；G418筛选阳性细胞；应用RT-PCR和Dot-ELISA方法分别在基因水平和蛋白水平对表达sHLA-G1的LCL721.221细胞进行鉴定；收集LCL721.221-sHLA-G1细胞培养液；将HB-95细胞注入Balb／c小鼠腹腔，产生含抗体的腹水后采用正辛酸-硫酸氨沉淀法纯化W6／32抗体，再用免疫亲和层析提纯sHLA-G1蛋白。【结果】核转染技术可以高效将pcDNA3-sHLA-G1质粒转入LCL721.221细胞，转染率约为14％，RT-PCR和Dot-ELISA的结果显示转染和筛选均获得成功；G418筛选出稳定表达sHLA-G1的LCL721.221细胞，应用免疫亲和层析方法提纯LCL721.221-sHLA-G1培养液中sHLA-G1纯化蛋白约1.3mg。【结论】核转染技术可以高效将pcDNA3-sHLA-G1转入LCL721.221细胞。免疫亲和层析方法成功提纯sHLA-G1纯化蛋白。第三部分可溶性HLA-G1抑制NK92的生物学功能的研究【目的】研究sHLA-G1对NK细胞的粘附功能、胞吐、杀伤活性以及释放细胞因子等功能的影响作用。【方法】利用细胞粘附实验研究sHLA-G1对NK92细胞在静止状态和滚动状态对猪血管内皮细胞系SV-40-PED粘附功能的抑制作用；借助β-hexosaminidase释放实验间接反映NK92细胞杀伤SV-40-PED时所释放的穿孔素、颗粒酶水平以及sHLA-G1对此的抑制作用；利用ELISA方法检测sHLA-G1对NK92所释放的IFN-γ、TNF-α水平的抑制作用；利用MTT方法检测sHLA-G1抑制NK92对SV-40-PED的杀伤作用。【结果】sHLA-G1无论是在静止状态下还是滚动状态下都能显著抑制NK92的粘附功能（P＜0.01）；β-hexosaminidase释放实验结果显示，NK细胞与靶细胞SV-40-PED相互作用2h，即有明显的胞吐效应，酶释放率达14.5％，随着时间延长，酶释放率增加，6h时达高峰64.5％，sHLA-G1组中NK92细胞的胞吐维持在较低水平，二者间有显著差异（P＜0.05）；ELISA实验结果显示对照组中NK92所释放的IFN-γ、TNF-α因子维持在一个较高的水平，sHLA-G1组中NK92所释放的IFN-γ、TNF-α因子较对照组有显著降低（P＜0.05）；MTT杀伤实验结果显示sHLA-G1组NK92对SV-40-PED的杀伤效率（25.5±2.1％）显著低于对照组（71.2±2.6％，P＜0.01）。【结论】sHLA-G1可以显著抑制NK92细胞的生物学功能，从而抑制NK92介导的异种移植排斥反应。第四部分人外周血单个核细胞移植给SCID小鼠异种GVHD模型的建立【目的】建立一种能直接观测异种器官移植给人的异种移植所发生的各种免疫反应的动物模型。【方法】阳性对照组：SCID小鼠经尾静脉注射5×107 C57BL／6小鼠脾细胞；人外周血单核细胞（hPBMC）组：SCID小鼠在实验前1d腹腔注射30μl anti-asialo GM1抗体，实验当天给予Co60照射（3.5Gy）、尾静脉注射5×107hPBMC；NK92组：根据预处理因素分为3组，A组SCID小鼠在实验前1d腹腔注射30μl生理盐水，实验当天给予Co60照射（3.5Gy）和尾静脉注射5×107NK92细胞；B组SCID小鼠在实验前1d腹腔注射30μl anti-asialo GM1抗体，实验当天给予Co60照射（3.5Gy）和尾静脉注射5×107 NK92细胞；C组SCID小鼠在实验前1d腹腔注射30μl anti-asialo GM1抗体，实验当天给予Co60照射（3.5Gy）和尾静脉注射5×107NK92细胞（NK92细胞悬液加入终浓度为200u／ml的rhlL-2）。观察各组SCID小鼠体重、体型、体位、毛发、腹泻和死亡时间；ELISA方法检测SCID小鼠（PBMC组和NK92组）IFN-γ、TNF-α的分泌水平；对死亡SCID小鼠行常规病理学检查。【结果】SCID小鼠在输注5×107 C57BL／6脾细胞5d后出现弓背、消瘦、皮毛紊乱无光泽、体重减轻等GVHD症状，7只SCID小鼠在5～8d内死亡，肝脏出现大面积肝细胞坏死，肝脏失去正常的结构，肝窦中有大量的淋巴细胞浸润；hPBMC组SCID小鼠在2周后开始出现GVHD症状，肝脏出现大面积肝细胞坏死，肝窦中有大量的淋巴细胞浸润，分别在15～25d内死亡；NK92组中A、B、C组SCID小鼠均未出现GVHD；ELISA检测结果显示hPBMC组中在发生异种GVHD时TNF-α的分泌水平明显升高，IFN-γ的水平也有一定程度上的升高，而在NK92组，IFN-γ、TNF-α的分泌水平较低，并且显现出持续降低趋势。【结论】成功建立人外周血单个核细胞移植给SCID小鼠异种GVHD模型，为研究异种移植排斥反应以及今后建立人移植物对猪的异种GVHD提供一定的启示。第五部分可溶性HLA-G1抑制外周血单个核细胞移植给SCID小鼠的异种GVHD【目的】研究sHLA-G1在体内环境中对T细胞活性的影响作用，并且抑制人外周血单个核细胞（hPBMC）移植给SCID小鼠发生的异种GVHD。【方法】采用单向混合淋巴细胞培养实验检测sHLA-G1对T细胞增殖能力的抑制作用；SCID小鼠在实验前1d腹腔注射30μl anti-asialo GM1抗体，实验当天给予Co60照射（3.5Gy）、尾静脉注射5×107 hPBMC细胞，其中实验组1、2中SCID小鼠分别经尾静脉注射2ng和4ng的sHLA-G1治疗（实验当天、3、6、9、12和15d），对照组SCID小鼠注射等量的生理盐水；ELISA方法检测各组SCID小鼠IFN-γ、TNF-α的分泌水平；取死亡SCID小鼠行常规病理学检查。【结果】对照组中hPBMC的增殖强度比实验组1和实验组2均有显著性增强（P＜0.05）；实验组1和实验组2中SCID小鼠存活时间比对照组有显著延长（P＜0.01）；对照组中SCID小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α水平随着GVHD症状的出现，IFN-γ、TNF-α水平显著升高，实验组1，2中SCID小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α水平一直维持在较低的水平；病理学检查对照组SCID小鼠肝脏出现大面积肝细胞坏死，肝脏失去正常的结构，肝窦中有大量的淋巴细胞浸润，而实验组中SCID小鼠肝脏病理学检查均为肝脏轻微可逆性病变，肝窦中仅有散在淋巴细胞浸润。【结论】sHLA-G1可以在体内环境中抑制T细胞的生物学功能，并且可以明显抑制hPBMC移植给SCID小鼠发生的异种GVHD。