论文部分内容阅读
重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin,rh-ES)是一种我国自主研发的具有抗非小细胞肺癌的蛋白类药物,目前大量的研究表明其对其它类的癌细胞也有抑制作用。重组人血管内皮抑制素为蛋白类药物,与其它蛋白类药物一样,稳定性较差,在体内循环时间短,目前通常将其制备成缓释靶向微球以提高药物的疗效、安全性与稳定性,但其制备工艺与添加剂等会对蛋白的活性造成影响,药物利用率低并产生突释现象,安全性低,同时制备的缓释靶向微球的体内靶向性评价比较繁琐,干扰较大,所以限制了其广泛的临床应用。本文通过静电喷雾技术在无添加剂、无乳化剂、无交联剂与低温的条件下实现一步法制备复合物载药微球,并通过新型的荧光成像材料量子点(QDs)标记rh-ES,共载于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)中,制备具有缓释靶向可示踪的复合载药微球,通过活体成像技术对微球的靶向性进行评价,并对其抗肿瘤效应进行考察。全文共分为以下五部分:一、综述本部分首先对蛋白多肽类药物微球的制备方法与制剂体内靶向性评价普遍存在的问题进行了简要的概述;其次对新型的微纳米粒子制备技术静电喷雾技术与荧光成像材料量子点的特点与应用进行介绍;最后总结了蛋白质模型药物rh-ES在抗肺癌方面的研究进展。二、水溶性量子点的制备与表征本部分通过两亲性聚合物实现油溶性量子点的包裹,实现量子点在水溶液中稳定的存在,并能成功标记蛋白类药物。首先合成两亲性聚合物,通过核磁共振光谱(~1H-NMR)与傅里叶红外变换光谱(FT-IR)确定聚合物的成功合成。再通过自组装实现QDs的包裹,得到的QDs产物具有较好的水溶性,粒径为35 nm左右。通过紫外和荧光光谱可以看出,改性的QDs具有较好的光学性能。稳定性研究发现其在不同的pH和离子强度条件下稳定性较好,未发生聚集。另外通过MTT法对聚合物和修饰后的QDs进行安全性评价,结果表明浓度在5~200μg/mL范围内,细胞的存活率均大于85%,表明修饰后的QDs安全性高,满足运用于体内实验的要求。三、量子点与重组人血管内皮抑制素复合物的制备及其性质考察本部分通过共价结合法实现rh-ES与QDs的结合。通过对1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)的用量、反应时间、反应pH值等因素进行考察,优化工艺处方。通过琼脂糖凝胶电泳确定rh-ES-QDs复合物成功制备,另外通过粒径测定可以看出标记前QDs的粒径为35±2.4 nm,电位为-19.27±2.1 mv,标记后rh-ES-QDs的粒径为94±3.5 nm,电位为-22.92±1.3 mv,间接表明QDs与蛋白成功结合。通过间接法计算rh-ES-QDs的平均偶联效率为80%。rh-ES-QDs的荧光稳定性、偶联稳定性以及光学性能均较好,并且蛋白的二级结构未受到影响。四、基于静电喷雾技术重组人血管内皮抑制素复合微球的制备与表征本部分首先建立了测定微球中rh-ES的含量与体外释放度的方法,并对方法进行验证。采用静电喷雾技术实现一步法制备PLGA-rh-ES-QDs微球。以PLGA-rh-ES-QDs-MS的形态粒径和包封率作为指标,通过单因素考察和中心复合设计,确定了微球制备的最佳工艺。通过扫描电镜(SEM)观察微球的表面形态良好,分散比较均匀。荧光显微镜表征微球具有良好的荧光性能。激光粒径仪(DLS)测定微球的粒径在4-8μm范围内,满足肺部被动靶向的要求。PLGA-rh-ES-QDs微球的包封率为85.46±1.57%,载药量为23.95±2.32μg/mg。载药微球在PBS(含0.02%F-68)中体外释放实验表明PLGA-rh-ES-QDs-MS具有较好的缓释效果,在15天时rh-ES累积释放达80%以上,并且未出现明显的突释现象。通过MTT实验对微球的生物相容性和生物活性进行考察,结果表明微球和载体材料的安全性较好,微球的释放液与原注射液具有相当的细胞增殖抑制率,表明制备成微球后,蛋白的活性保持较好。五、体内药动学及靶向性与药效学评价本部分首先建立酶联免疫法(ELISA)测定SD大鼠血清中重组人血管内皮抑制素的浓度。体内药动学结果显示将其制备成微球后,在72 h时仍能检测到药物,消除半衰期从3.46 h增加到65.35 h,药物在体内的平均滞留时间(MRT)也从4.03 h增加到257.45 h,表明通过静电喷雾技术制备的PLGA-rh-ES-QDs-MS具有明显的缓释效果。其次通过活体成像技术对微球的靶向性进行评价,结果显示微球组经尾静脉注射吸收后大部分被肺部截留,原料组在肺部也有一定的分布,但是荧光强度明显低于微球组,表明通过静电喷雾技术制备的微球具有一定的肺部靶向性。最后通过荷瘤小鼠评价制备的PLGA-rh-ES-QDs-MS的药效学,从肿瘤的重量、体积变化以及肿瘤组织切片均可以判断微球具有较好的抗肿瘤效应,与生理盐水组相比抑瘤效率为38.4%。由小鼠体重的变化曲线和体内组织的HE染色可以看出,PLGA-rh-ES-QDs-MS的安全性较好。