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Mx蛋白是干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一,具有广谱的抗病毒效应,能使细胞进入抗病毒状态。哺乳动物(包括人)、鸟类以及鱼类体内都发现有Mx蛋白。90年代起,Mx蛋白的研究逐渐引起人们的重视。本研究以牙鲆为材料,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到其Mx基因的cDNA序列,构建pPIC9K-Mx表达载体,并在毕氏酵母中实现了牙鲆Mx蛋白的真核表达,为以后进一步研究牙鲆Mx蛋白的抗病毒机制打下了良好的基础。我们首先提取了牙鲆(Paralichthys lethostigma)肾脏的总RNA,反转录得cDNA。我们在NCBI GenBank网站搜索目前已知的Mx蛋白基因家族各成员的蛋白和核酸序列,用DNASTAR软件编辑所得的序列,并对Mx基因家族各成员的氨基酸序列进行Megalign比较,找出各成员同源性最高、保守性最强的片段,以设计性引物,进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增。将RT-PCR产物纯化并连接至pEM-T载体,转化大肠杆菌DH5a菌株进行克隆测序。测序结果表明,RT-PCR所得的cDNA片段全长1980bp,其中编码区长1890bp,编码629个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为71.7kDa。随后,我们在NCBI网站对RT-PCR所得的基因序列进行比较分析,Blast比较以及Megalign软件分析的结果表明此cDNA片段具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构区。至此,我们获得了牙鲆Mx基因的全长cDNA片段。进一步的序列比较与进化分析结果表明,牙鲆Mx基因与日本比目鱼等鱼类的同源性较高,在75.1%～98.7%之间;而与哺乳动物的同源性相对较低,在50.3%～55.1%之间。我们选择能够在毕氏酵母中特异表达的载体pPIC9K,构建了可以在E. coli和毕氏酵母GS115中表达的穿梭质粒pPIC9K-Mx,氯化钙法转化E. coli后,提取pPIC9K-Mx质粒并用sacI限制性内切酶线性化,电击转化毕氏酵母。在MGY(Minimal Glycerol Medium)培养基上筛选得到转Mx基因的酵母菌,然后通过PCR方法进行鉴定,结果显示牙鲆Mx基因已整合进入酵母基因组中。转化后酵母菌株经甲醇诱导后能够表达Mx蛋白并分泌到细胞外,经50%的硫酸铵沉淀后,SDS-PAGE电泳可以检测到表达的Mx蛋白。