凝血酶识别序列连接的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（STH）的高密度发酵、纯化及功能研究　　 目的：建立凝血酶识别序列连接的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（staphylokinaselinked with hirudin by thrombin recognition peptide，STH）的高密度发酵及其分离纯化工艺，以获得足量的蛋白，并对其体外和体内功能进行研究。　　 方法：40L 发酵罐高密度发酵后，离心收集菌体，反复冻融后收集上清液，经超滤、两步阴离子交换层析，分离纯化目的蛋白STH。以SDS-PAGE 电泳和反相高效液相色谱（RP-HPLC）鉴定纯化获得的STH的纯度，琼脂糖-纤维蛋白溶圈法检测纯化样品STH的溶栓活性。SDS-PAGE和Western Blot 分析STH的裂解情况，发色底物法和纤维蛋白凝块溶解法分析STH 及其裂解产物的抗凝活性，琼脂糖-纤维蛋白溶圈法、发色底物法和纤维蛋白凝块溶解法分析STH 及其裂解产物的溶栓活性，凝血酶亲和实验和纤维蛋白凝块溶解法分析STH 对凝血酶的亲和力，血栓弹力图在体外分析STH 对血栓的溶栓与抗凝活性，大鼠下腔静脉血栓模型和小鼠尾部横切出血模型在体内检测STH的溶栓和抗凝活性及其出血副作用。　　 结果：经过20h 发酵后菌体干重达到32.20g/L，目的蛋白表达量可达1.48g/L。两步阴离子交换层析纯化后的STH的纯度为98％以上，溶栓比活性2.6×104IU/mg，活性回收率56％，相对分子质量2.3×104Da。SDS-PAGE和Western Blot 实验结果显示STH 成功地被凝血酶识别并裂解，发色底物法分析结果表明STH 中HV2的N-末端成功地被SAK和连接肽封闭，从而封闭了其抗凝活性；当STH 被凝血酶裂解后可以释放出部分的抗凝活性，约为等摩尔HV2 35.68％的抗凝活性。发色底物法和血栓弹力图结果显示STH和SAK 具有相同的溶栓活性。凝血酶亲和实验和纤维蛋白凝块溶解实验分析显示STH 中HV2的C-末端仍然保持了对凝血酶的高亲和力，从而使STH具有了对血栓的靶向性。纤维蛋白凝块溶解法实验结果显示STH 能够被凝块中的凝血酶裂解并释放出抗凝活性，从而发挥溶栓和抗凝双重功能。体内实验结果显示，STH 在表现出更高的溶解血栓能力的同时还表现出较低的出血副作用。　　 结论：建立了STH的生产工艺，该工艺简便，时程短，重复性好，适合于大规模生产。从体外和体内两个方面考察了STH的功能，结果显示STH 在表现出溶栓和抗凝双功能的同时还表现出对血栓具有一定的靶向性，而显示出较低的出血副作用。　　 Fxa 识别序列连接的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（SFH）原液质量标准初步研究　　 目的：建立Fxa 识别序列连接的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白（staphylokinase linkedwith hirudin by Fxa recognition peptide，SFH）原液的质量标准。　　 方法：参考《中华人民共和国药典》2005年版（三部）和生物制品相关指导原则，对SFH 原液进行了以下项目的质量标准研究：采用Lowry 法进行蛋白含量测定，非还原性SDS-PAGE 电泳和RP-HPLC 进行纯度测定，溶菌圈法进行抗生素残留测定，发色底物法进行抗凝活性检测。　　 结果：三批SFH 原液的蛋白含量经Lowry 法检测结果分别是：18.48、24.85和23.96mg/ml，均符合拟定的大于15mg/ml的标准；SDS-PAGE电泳法检测三批SFH 原液纯度结果分别为96％、97％和97％，均符合拟定的大于95％的标准；RP-HPLC 法检测三批SFH 原液纯度结果分别为99.32％、100％和100％，均符合拟定的大于95％的标准；溶菌圈法检测三批SFH 原液的抗生素残留均为阴性；发色底物法检测三批SFH 原液裂解0h的抗凝活性分别为3.32％、-7.63％和3.77％，符合拟定的±10％的范围；发色底物法检测三批SFH 原液裂解3h的抗凝活性分别为72.24％、60.72％和65.08％，符合拟定的大于50％的标准。　　 结论：建立了SFH 原液的蛋白含量测定方法、纯度测定方法、残留抗生素检测方法和抗凝活性检测方法。采用拟定的质量控制方法对本实验室生产的三批SFH 原液进行质量鉴定，结果均符合中国药品生物制品检定所制定的关于生物制品申报临床研究的相关规定。