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球毛壳菌(Chaetomium globosum)是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌,含有很多优良的生物防治基因,球毛壳菌46kD几丁质酶(chi46)就是其中之一。几丁质酶(chitinase Ec.3.2.14)能够催化病原真菌细胞壁几丁质水解为几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞和组织中,参与多种生理过程。几丁质酶在生物防治和几丁质资源的利用等方面具有巨大的应用潜力,因而受到了广泛的重视。为了利用重组几丁质酶生产广谱抗性的生物农药,鉴于毕赤酵母(Pichia pastoris)易于培养、外源蛋白表达量高等特点,故本研究采用毕赤酵母分泌表达系统作为表达生产工具,从已构建好的质粒pGEX-chi中通过设计的引物扩增出球毛壳菌chi46基因,将经EcoR I和Not I双酶切的chi46基因和酵母表达载体pPIC9进行体外连接,构建酵母重组表达载体,经过菌液PCR检测,双酶切检测并测序,得到有正确阅读框的重组表达质粒pPIC9-chi6。将pPIC9-chi6和pPIC9空质粒分别用限制性内切酶Stu I线性化后,采用电转化的方法分别转化GS115和KM71酵母感受态细胞,经过甲醇利用表型的筛选和PCR检测筛选得到2株高效利用甲醇GS115型和3株低效利用甲醇KM71型阳性转化子。通过检测各转化子发酵液上清每隔24h的蛋白表达情况和酶活情况筛选出高效表达CHI46的工程菌株G6-5和K6-9。对两株工程菌株分泌的重组CHI46粗酶液进行了酶活测定与酶学特性研究,同时对于重组CHI46的抑菌性进行了初步摸索。发现GS115转化子G6-5比KM71转化子K6-9的产酶高峰出现晚3d左右,产酶活力较后者高8.24%。重组CHI46在35℃-65℃的温度范围内,保持着相对稳定的酶活性；重组CHI46亦有很广的pH耐受范围,在pH3-10有较稳定的酶活力。这揭示出它生防领域中良好的应用前景。确定酶系统发挥活性的最佳组合,即反应体系Cu2+ 5mmol/L,温度45℃,pH值5.0,依照该体系以N.O-羧甲基壳聚糖为底物测得的重组CHI46发酵液酶活能达到30.19U。对不同底物的酶活测定结果表明,重组CHI46对于真菌细胞壁的酶活普遍较化合物高。重组CHI46粗酶液对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、杨树叶枯病菌(Alternaria alternata)、杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)的生长具有一定抑制作用,从而证明了重组CHI46具有降解病原真菌细胞壁的能力。几丁质酶的研究是一项具有重要经济价值与理论价值的研究课题。球毛壳几丁质酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物同样具有几丁质酶抑制真菌生长的优良特性,这就预示了表达几丁质酶在几丁质工业和生物学领域的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行改造,寻找合适的发酵工艺、探索使酶活稳定的方法,获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株,生产针对植物真菌病害防治的生物农药。