DR-pprM/pprI转基因果蝇辐射抗性及丝裂霉素C抗性研究

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目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)对电离辐射、丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)和过氧化氢等极端环境因素的冲击有强大抵抗力,课题组前期结果表明耐辐射奇球菌pprM/pprI基因在其极端环境生存中发挥了极大的作用。本研究主要通过使用137Cs-γ射线辐照和MMC处理DR-pprM/pprI转基因果蝇,然后观察其各项生理、氧化应激指标和DNA损伤情况,研究pprM/pprI基因对果蝇辐射抗性和MMC抗性的影响,以及耐辐射奇球菌pprM/pprI基因在黑腹果蝇机体内的功能与作用机制。为人类辐射防护的研究和临床上MMC的使用提供理论依据。方法:1.PCR技术鉴定DR-pprM/pprI转基因果蝇。采用不同剂量(0-2000 Gy)137Cs-γ射线处理DR-pprM、DR-pprI转基因果蝇和对照果蝇yw25C6、yw68A4,测定其生殖、生存和运动能力,观察各组果蝇辐照后是否产生畸形情况,并统计畸形率。2.使用含不同浓度MMC(0、40、80μg/mL)的培养基喂养DR-pprM/pprI转基因果蝇和对照果蝇yw25C6、yw68A4,测定其生殖、生存和运动能力,探究pprM和pprI基因是否能够提高果蝇的抗丝裂霉素C能力。用不同浓度MMC(0、40、80μg/mL)喂养各组果蝇14天后提取果蝇的总蛋白,并分别检测各组果蝇的总活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)活力、总超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量和还原型谷胱甘肽(GSH)含量。评价MMC处理前后各品系果蝇成虫的氧化损伤情况。结果:1.通过PCR鉴定pprI、pprM基因仍分别存在于本实验室制备的转基因果蝇基因组内,未发生丢失,前期本实验室已证明pprI、pprM基因在果蝇体内可以稳定表达。随着辐照剂量的升高,果蝇的存活率降低,当辐照剂量达到2000 Gy时,实验组果蝇辐照后24 h死亡率明显高于对照组(P<0.05);当辐照剂量达到100 Gy时,实验组果蝇运动能力明显高于对照组(P<0.05);辐射剂量为0 Gy时,实验组的生殖能力与对照组基本一致,辐照剂量为50 Gy时,DR-pprM转基因果蝇的生殖能力明显高于对照组果蝇(P<0.05)。辐射剂量为100 Gy时,pprI转基因果蝇和pprM转基因果蝇生殖能力均高于其对照组果蝇,具有统计学差异(P<0.05)。辐照剂量为210 Gy时,DR-pprM/pprI转基因果蝇的畸形率明显低于对照组果蝇(P<0.05)。在相同条件的辐照处理下,DR-pprM/pprI转基因组果蝇的生存、运动和繁殖能力均高于对照组果蝇(P<0.05),且畸形率比对照组低(P<0.05),而DR-pprM转基因果蝇与DR-pprI转基因果蝇在相同辐照剂量下各指标均无明显差异,说明pprI和pprM基因均可以提高果蝇的辐射抗性,但pprI与pprM基因相比对果蝇的辐射抗性的提高没有显著差异。2.通过使用不同浓度的MMC处理转基因果蝇和对照果蝇,观察果蝇的生长状况、攀爬能力和产卵量,发现当丝裂霉素浓度达到80μg/mL时,pprM/pprI转基因果蝇的生存、攀爬和生育能力均高于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。说明pprM和pprI基因可以降低丝裂霉素对果蝇造成的损伤,pprM和pprI基因均可以提高果蝇抗丝裂霉素C的能力,但pprI与pprM基因相比对果蝇的MMC抗性的提高没有显著差异。使用0、40、80μg/mLMMC浓度组处理pprI、pprM转基因和对照果蝇,分别检测果蝇的ROS、SOD、MDA、GSH和CAT指标,结果表明,同浓度下转基因果蝇与对照组相比,SOD、GSH、CAT活性升高,ROS、MDA含量降低,表明pprI和pprM基因在果蝇体内可能通过提高其抗氧化酶类的活性,减少MMC对果蝇的损伤。结论:1.耐辐射奇球菌pprM和pprI基因的异源靶入能明显提高黑腹果蝇的电离辐射抗性;DR-pprM/pprI基因可以提高果蝇辐照后的生存、运动和繁殖能力,并降低辐照后果蝇的畸形率。2.DR-pprM和pprI基因的靶入能明显提高果蝇的抗MMC能力。DR-pprM/pprI基因可通过提高果蝇的抗氧化酶的活性来提高果蝇MMC处理后的生存、运动和繁殖能力。
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