研究背景随着全世界航空航天事业的蓬勃发展,人类向太空领域的探索和开发越来越频繁,空间环境对生物体及人类机体的影响已成为科学领域的研究热点。微重力是空间环境的主要特点之一,探索微重力对机体的影响以及如何对抗这些影响是航天医学所面临的重要问题。地球上的生物都是在1G重力环境中生长和发育的,因此重力环境的改变势必对其生理系统产生影响。如宇航员在执行空间任务或长期的舱内训练后会出现心肺功能紊乱、免疫功能失调、骨质疏松、贫血、鼻出血和关节腔出血、感知觉改变等,这些变化的发生机制的研究对航天员的健康以及人类进行长久的空间探索有重要意义。长期以来航天医学家着力于动物、组织及细胞分子生物学层面对模拟微重力效应的机制进行深入研究,并已经对成骨细胞、造血干细胞、红细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、表皮细胞、免疫细胞、神经细胞以及血小板等数十种细胞从形态、增殖、功能等方面做了相应的研究工作,并且对相关机制有了一些初步的认识。多年来,国内外对微重力状态下造血系统改变的相关研究主要集中在“航天性贫血”方面,而目前航天员免疫功能下降及凝血功能改变逐渐得到关注。循证航天医学研究者对航天飞行中航天员发生的各种医学问题作了相关统计,数据表明部分航天员在执行空间任务时出现出血或血栓症状,并发现航天员血小板功能发生改变,因此微重力对凝血系统的影响有待深入探索和研究。目前关于微重力对凝血功能影响的研究报道较少。最早的相关报道为1976年一项空间飞行实验证实空间飞行后小鼠的巨核细胞形态发生改变。后于2001年有文献报道模拟微重力使人体血小板计数增加但体积减小,2002年Fuse A等报道了模拟微重力使小鼠外周血血小板计数减少,2009年北京航空航天大学生物与医学工程学院戴克胜等报道了太空失重环境下人和啮齿类动物血小板功能会发生改变,并地面模拟实验发现模拟微重力条件下血小板形态改变,GP Ⅰ b/Ⅸ/Ⅴ的主要功能亚单位GPⅠba在血小板表面的表达水平显著减少,血小板和vWF的结合能力减弱,粘附及聚集能力下降,动物实验证明模拟微重力使小鼠尾静脉出血时间延长。那么,人体血液中血小板寿命仅7-9天,每天至少有十分之一的血小板由巨核细胞产生更新,并其膜表面糖蛋白和释放的细胞因子等均在巨核细胞阶段合成,因此研究微重力对血小板的母体—巨核细胞的效应对探究微重力条件下血小板粘附、聚集功能改变的机制及模拟微重力对凝血系统的影响有重要意义。巨核细胞(megakaryocyte, MK)的生成是一个复杂的生物学过程,包括造血干细胞发育为巨核祖细胞,再进一步分化为成熟的巨核细胞并释出血小板。祖细胞阶段的细胞核内的染色体一般是2-3倍体,细胞具有增殖能力。当巨核系祖细胞进一步分化即可通过核分裂而胞质不分裂的方式成为成熟的多倍体细胞并产生血小板,同时,在分化的过程中,特异性表面抗原CD41、CD61、c-mpl等表达量会逐渐增多。巨核细胞增殖和分化的调节机制类似于红细胞系生成的调节,至少受巨核系集落刺激因子(Meg-CSF)和促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)两种调节因子对各个分化阶段进行调节。其中TPO又名巨核细胞生长因子,通过与其受体c-mpl特异性结合可增加巨核细胞的总数,刺激巨核细胞合成蛋白质,增强祖细胞的DNA合成和增加细胞多倍体的倍数,最终增加血小板的生成；并且也参与调节早期造血和造血干细胞发育以及数量的维持。c-mpl与TPO结合后引起c-mpl的同源二聚化,进而激活酪氨酸激酶(JAK)家族启动Jak/STAT、PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路,并激活信号分子发挥调节作用,而c-mpl的表达减少能关闭TPO信号,而使巨核细胞的增殖和分化成熟受阻。在细胞增殖和成熟过程中,往往由胞内正调控因子和负调控因子共同作用使之达到一种稳定的生理状态,GATA-1(GATA binding protein1,核内反应基因1)、NF-E2(Erythroid Nuclear Factor2,红细胞系核因子2)、FOG-1(Friend of GATA-1)、FLI-1(Friend leukemia virus integrationl,白血病病毒综合因子1)、RUNX-1(Runtrelated transcription factor1, Rant相关转录因子1,也叫AML-1)、Ets-1(E26transformation-specific-1, E26转录因子1)、Meis-1、c-myb、spl等转录因子即在巨核细胞增殖和分化成熟的调控中起关键作用。其中,NF-E2作用于巨核细胞分化成熟晚期阶段,为巨核细胞胞质成熟、颗粒形成和血小板的发育所必需,GATA-1、RUNX-1、Ets-1、FLI-1、Meis-1、FOG-1等通常通过协同作用参与包括c-mpl、PF4、GPⅡb等在内的多种靶基因的转录调控。Ets-1、FLI-1不仅参与巨核细胞c-mpl、GPⅠbα、GPⅤ、GPⅥ、GPⅨ、vWF、PF4等基因的转录调控,Ets-1还可激活DNA与RUNX-1的结合,调控巨核细胞分化。RUNX-1可通过与不同的转录因子如GATA-1、Ets-1、CBF-β (Core-binding factor subunit beta)等结合调控不同阶段巨核细胞的分化。RUNX-1与转录激活因子p300组成复合体可促进c-mpl的转录激活,可与CBF-β、GATA-1、FLI-1、FOG-1组成复合体启动c-mpl基因转录,并相关研究指出当RUNX-1、CBF-β、GATA-1、FLI-1、 FOG-1同时存在组成复合体时才能启动c-mpl基因的转录激活。综上所述,任何一个转录因子表达异常均可能导致巨核细胞增殖分化障碍。因此,本实验即通过检测巨核细胞的增殖、特异性抗原表达、c-mpl表达及相关转录因子的表达情况研究模拟微重力对巨核细胞增殖分化的影响及机制。目前,可以通过空间搭载和地基模型两种方式获得微重力而进行生物体的微重力效应研究,但是空间搭载的实验机会少,条件苛刻,且耗费巨大,不能满足对空间环境的深入探索和研究。小鼠尾吊模型及由美国宇航局(NASA)开发研制的旋转细胞培养系统(Rotary cell culture system, RCCS)弥补了这个缺陷,RCCS是目前公认的地面模拟微重力环境的培养装置,它是一种在地面条件下模拟微重力环境的细胞培养装置,实验结果和真实微重力有很好的相关性,可以用来做关于微重力的研究。本实验使用第四代RCCS (RCCS-4)模拟微重力观察巨核细胞的增殖和分化情况并探索其机制。另外,由于巨核细胞在骨髓中所占的比例甚少,分离纯化困难,在体外不能长期培养,目前常使用巨核细胞株作为研究模型,本实验的研究对象即是具有巨核细胞生物学特性且性状稳定的人巨核细胞白血病来源的CHRF-288-11细胞系。研究目的本实验旨在研究模拟微重力对巨核细胞增殖和分化的影响及机制以进一步探究微重力环境对出凝血系统的影响。研究方法本实验应用第四代旋转细胞培养系统RCCS-4模拟微重力,用人巨核细胞白血病来源的CHRF-288-11细胞系作为巨核细胞模型。实验分为普通培养组(NG组)和模拟微重力培养组(SMG组),分别培养24h、48h、72h,研究模拟微重力对体外培养巨核细胞增殖和分化的影响及其机制。首先采用台盼蓝染色法判断两种培养条件下细胞的活力。进而,采用细胞计数及CCK8法比较两种培养条件细胞的增殖情况；采用流式细胞术检测细胞周期及细胞表面CD41、CD61表达以比较两种培养条件巨核细胞的分化情况；采用RT-PCR法及Western blot法检测巨核细胞血小板生成素受体c-mpl的mRNA及蛋白表达水平,采用RT-PCR法检测巨核细胞增殖分化相关的重要转录因子GATA-1、NF-E2. RUNX-1、Ets-1、Meis-1的mRNA表达水平,以探索相关机制。本实验为独立重复实验,不同时间点之间无相关性,每组实验至少重复3次。数据分析采用SPSS13.0软件,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,用两独立样本t检验法分析比较,P<0.05有统计学差异。研究结果将细胞分别在普通培养条件和模拟微重力条件下培养,分别培养24h、48h、72h后：(1)SMG组CHRF-288-11细胞活力与NG组无显著差异,细胞活力均保持在80%以上。(2)SMG组细胞计数及CCK8法测得的450nm处吸光度(optical delnsity, OD值)均显著低于NG组。(3)SMG组G2/M期细胞比例显著低于NG组。(4)培养24h时SMG组与NG组CD41+CD61+细胞比例无显著差异,培养48h、72h后SMG组CD41+CD61+细胞比例显著低于NG组。(5)SMG组细胞c-mpl mRNA及蛋白表达水平均显著低于NG组。(6)使用50ng/ml TPO刺激CHRF-288-11细胞72h,可使普通培养组细胞c-mpl mRNA表达量上调而未能使SMG组细胞c-mpl mRNA表达上调。(7)与NG组比较,在培养24h、48h、72h时SMG组GATA-1mRNA表达量均上调；培养72h时SMG组NF-E2mRNA表达量上调；培养48h、72h时SMG组RUNX-1、Ets-1mRNA表达量下调。结论模拟微重力可以抑制体外培养巨核细胞的增殖和分化,其机制可能是由于巨核细胞存在重力敏感分子,在微重力条件下重力敏感分子表达改变而导致细胞增殖分化发生变化。其中转录因子RUNX-1、Ets-1下调导致c-mpl基因转录激活障碍,c-mpl表达水平下调,部分关闭了c-mpl介导的信号通路可能是模拟微重力环境巨核细胞增殖和分化被抑制的相关机制。