【摘 要】
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在源远流长的历史进程中,人类对生命规律本质的探索从未停歇。大到多细胞的动物、植物,小至单细胞的细菌、真菌,所有生物都能对外界刺激做出一定的响应。生物学的发展历史表明,诸多改变人类对生命认识的事件都与微生物有着千丝万缕的联系。在本篇论文中,我们以大肠杆菌(Escherichia coli)为研究对象,应用物理学的概念和方法研究其结构和功能之间的关系。外部刺激是如何被感知?内部信号为什么要经过放大?细
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在源远流长的历史进程中,人类对生命规律本质的探索从未停歇。大到多细胞的动物、植物,小至单细胞的细菌、真菌,所有生物都能对外界刺激做出一定的响应。生物学的发展历史表明,诸多改变人类对生命认识的事件都与微生物有着千丝万缕的联系。在本篇论文中,我们以大肠杆菌(Escherichia coli)为研究对象,应用物理学的概念和方法研究其结构和功能之间的关系。外部刺激是如何被感知?内部信号为什么要经过放大?细菌个体和群体之间又有哪些联系?通过对目标对象的定量研究,旨在阐明生物体在一定时间,空间内能量、物质、信息的规律。在第一章绪论中,主要介绍了大肠杆菌的研究进展和相关的背景知识。首先,直观上描述了大肠杆菌的形态与结构,代谢与增殖。然后,结合大肠杆菌受体蛋白和体内信号蛋白的结构和功能,介绍了趋化信号转导网络,细菌的运动行为。鞭毛马达作为驱动大肠杆菌在液体中运动的动力来源,我们将从马达的基体部分、外部连接部分、以及螺旋形的鞭毛进行介绍,阐述马达的转向改变、力矩输出、定子蛋白的动态交换与外部环境的关系。最后,简要说明变形菌视紫红质蛋白在大肠杆菌体内的应用原理和目前研究大肠杆菌的一些常用技术。在论文的第二章中,我们介绍了细菌的培养和菌种的改造方法:培养液和运动液的配制步骤,菌种的保存条件,基因扩增PCR技术,目标基因的敲除,质粒的构建与导入,以及荧光蛋白标记等。在论文的第三章中,我们研究了第二信使分子(c-di-GMP)对细菌运动的调节以及促进细菌在表面的聚集。在大肠杆菌体内,含有PilZ结构域的蛋白YcgR作为c-di-GMP的效应蛋白,构成c-di-GMP::YcgR后可以抑制鞭毛马达的转动。近二十年来,关于c-di-GMP::YcgR在鞭毛马达上作用的位置问题,一直是学术界讨论的热点。为了研究这一问题,我们搭建了双层光路显微镜。通过对转动细菌明场和荧光图像的同时采集分析,我们发现与c-di-GMP::YcgR蛋白相互作用的位点主要位于马达的C环上,而非在定子上。除此之外,力矩-速度曲线作为马达输出的重要属性之一,我们也测量了马达在逆时针转动(CCW)状态下,第二信使分子对力矩-速度曲线的影响。之后我们进一步研究了第二信使分子对马达转向,以及细菌运动行为的影响。在论文的第四章中,我们通过对马达转速的波动分析,测量了大肠杆菌鞭毛马达内部负载的转动摩擦阻力系数。在实验部分,我们记录了在不同负载(1.0μm;0.75μm;0.5μm)下的“马达复活”数据,并进行了野生型马达实验。在理论推导部分,我们结合朗之万方程描述马达外部负载(小球)和内部负载(马达转子)之间的关系,推出转子的转动摩擦系数与外部负载以及马达处定子个数无关,对应在不同负载不同定子数情况时马达转速功率谱中的“拐点”(rolloff frequency)位置相同。在补充实验中,我们排除了鞭毛过长以及采样频率不同带来的实验影响。这个实验的测量结果为鞭毛马达的建模提供了重要参数。在论文的第五章中,我们围绕鞭毛马达动力学机制其它方面进行了的探索。其一,我们通过马达转动表征胞体质子电动势(PMF),进而研究细菌对溶液酸碱度的响应。其二,我们测量了单马达和多马达细菌对阶跃刺激的响应延迟。在论文的最后一章中,我们对本论文的工作进行了总结和展望。本论文两项主要工作都是研究细菌鞭毛马达的动力学机制。一项工作研究小分子(第二信使分子)对马达性质的影响及其机制,发现c-di-GMP同时影响马达转速及转向偏向性,从而使细菌更容易聚集在固体表面。这与c-di-GMP在以下生理过程中的关键作用一致:细菌从运动到静止形成生物被膜之间转换。另一项工作通过波动分析测量了马达转子的转动阻力系数,得到的新数值为马达更新建模提供了重要参数。
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