论文部分内容阅读
肝刺激因子(HepaticStimulatorSubstance，HSS)是从新生动物肝脏或部分肝切除术后的残余肝脏中提取的一种活性蛋白。在目前所知的几种具有肝脏保护及促肝细胞再生作用的细胞因子当中，HSS是仅知具有器官特异性，而无种属特异性的促肝细胞增殖因子。既往实验证明HSS可特异性刺激肝细胞或肝源性肿瘤细胞增殖；可减轻CCl4、半乳糖胺及双氧水等药物对肝细胞的损伤；HSS还具有抑制肝纤维化及抗病毒的作用；此外，HSS的表达可增强肝癌细胞BEL-7402的抗凋亡作用。虽然对HSS的功能有了一定的了解，但至今仍对HSS理化性质的研究甚少，只是在用化学方法从组织中提取HSS时发现：HSS在65℃时加热15min后能保持其生物学活性，甚至在100℃加热15min后仍具有部分生物学活性；并且在pH值2.0～9.0的溶液中生物学活性均无改变。这在一定程度上限制了对HSS功能的深入研究，而且对肝脏的这些特异性的作用及其在临床的应用前景，需要人们更多的揭示出HSS的分子特性、基因功能及其作用的分子机制。
然而由于HSS在肝细胞中含量甚微、纯化困难，至今未分离到理想的生化纯品。随着DNA重组技术的发展，本实验室构建了pET42a-hHSS融合蛋白表达体系，酶切纯化后得到hHSS单体。再利用波谱学技术对重组hHSS在不同的pH值溶液和不同的温度下的结构上的变化进行研究，目的是进一步阐明HSS的物理和化学上的特性，为今后深入研究HSS的结构和作用机制奠定基础。首先利用本实验室已构建的hHSS原核表达载体经诱导表达后，获得纯化的重组hHSS。将hHSS基因片段定向插入pET42a(+)载体相应位点，构建pET42a-hHSS融合蛋白表达载体。通过转化感受态细菌BL21(DE3)，以IPTG诱导GST-hHSS融合蛋白表达，通过GSTrap亲和层析纯化，获得GST/hHSS融合蛋白，并以FactorXa切除GST获得hHSS单体。
经SDS-PAGE分析重组hHSS的纯度和相对分子量，再用蛋白印迹杂交(WesternBlot)及蛋白质肽指纹图谱分析鉴定hHSS。实验同时以一维等电聚焦电泳方法测定hHSS重组蛋白的等电点，利用流式细胞术检测hHSS重组蛋白的抗凋亡作用，以1.0μg/ml的rhHSS预先作用于BEL-7402细胞1.5h，加H2O2(终浓度为800μM)处理6h，收集细胞以FITC-AnnexinV/PI双染，流式细胞仪分选计数检测重组hHSS的抗凋亡作用。
为进一步研究重组hHSS的理化性质，利用同步荧光光谱技术和圆二色(CD)光谱技术对hHSS在不同的微环境中结构的变化进行研究。将1.0μMhHSS溶液在不同pH值(pH=2～12)溶液中变性12h；或在不同温度下(25℃～100℃)变性15min，记录其同步荧光光谱。并将0.3mg/mlhHSS溶液经上述变性处理后，记录hHSS溶液的远紫外CD谱。不同因素处理的hHSS经复性后，再分别记录其同步荧光光谱和远紫外CD谱。
结果表明：hHSS可在pET42a(+)原核表达体系中有效表达。分离纯化GST-hHSS重组蛋白分子量为48kD；以FactorXa切割GST-hHSS，可得到33kD和15kD两条蛋白带，其中33kD条带与GST分子量相符，而15kD条带的分子量与HSS基因序列推测结果一致；与小鼠的hHSS抗血清进行蛋白杂交后初步确定为hHSS，经蛋白质肽指纹图谱分析，可确定样品的肽指纹图谱与其理论图谱基本相匹配。经一维等电聚焦电泳测定hHSS重组蛋白的等电点为4.50。
利用流式细胞术与未加重组hHSS的对照组进行比较，加重组hHSS对照组的细胞凋亡率为32.4％，而处理组的凋亡率显著降低为22.7％，经统计学分析，P＜0.01，二者具有显著性差异。说明未经处理的重组hHSS蛋白具有生物学功能，能增强BEL-7402细胞的抗凋亡作用。
通过同步荧光光谱技术和圆二色光谱技术对重组hHSS的研究发现：在pH值＜4时，hHSS溶液的Trp残基同步荧光最大峰值开始发生蓝移，并且通过与游离Trp和Tyr同步荧光光谱比较，在pH≦3或pH≧10时hHSS溶液的相对荧光强度减弱，说明此时蛋白质构象发生改变。在研究温度对hHSS的影响时，我们发现只有在温度＞90℃时，hHSS的Trp残基同步荧光峰值才发生红移；同时在温度≧80℃时，其相对荧光强度才明显降低。对hHSS的二级结构进行研究时，Far-UVCD谱显示，在pH4至pH2和pH10至pH12时，重组hHSS的α螺旋明显减少，β折叠增多；或在温度≧83℃时，重组hHSS的α螺旋也明显减少，无规卷曲却显著增加。在二级结构发生改变时，再测其生物活性，发现促细胞抗凋亡作用消失。经复性处理后，同步荧光的峰值及峰位部分恢复，而CD谱却无明显改变，同时发现其生物学活性仍未恢复。
综上所述，利用基因重组技术，经原核表达系统获得的重组hHSS，能增强细胞的抗凋亡能力，说明其能在体外正确折叠，具有生物学活性；并且重组hHSS二级结构非常稳定，只在pH≦4、pH≧10的环境中或温度＞80℃时构象才发生改变。