论文部分内容阅读
目的:邻苯三甲酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)作为一种较为常见的增塑剂,广泛地用于日常生活中,其生殖毒性也日益引起大家关注。已有研究显示,TOCP可损伤雄性生精功能,影响精子发生。然而其对成熟精子功能是否有影响尚未见报道。本课题通过慢性染毒模型和体外孵育方法观察TOCP对小鼠成熟精子功能的影响,并探索精子特异性离子通道CatSper和Slo3在其中的作用。为揭示TOCP等增塑剂对雄性生殖系统损害的分子机制及为临床诊疗相关生殖疾病提供新思路与新方法。方法:1、分别以不同剂量(0、100、200、400mg/kg/d)的TOCP灌胃建立慢性染毒小鼠模型。2、通过测量染毒小鼠睾丸系数、睾丸组织的HE染色以观察TOCP对小鼠睾丸组织的生殖毒性。3、分别采用0、0.25、0.5、1mmol/L等不同浓度TOCP孵育小鼠精子1h后行体外相关实验。4、运用计算机辅助精子分析系统(CASA)观察慢性染毒与体外孵育的小鼠精子的活率、运动力情况。5、利用(CTC)金霉素染色法检测慢性染毒与体外孵育小鼠精子的自发性与P4诱发性顶体反应率的变化。6、采用免疫蛋白印迹方法(Western Blot)检测慢性染毒小鼠精子特异性钙通道CatSper1-4和钾通道Slo3的蛋白表达水平变化。7、利用精子全细胞膜片钳技术记录慢性染毒与体外孵育下CatSper和Slo3通道电流(ICatSper和IKsper)。结果:1、HE染色结果显示,100mg/kg/d TOCP处理组的小鼠睾丸曲细精管无明显破坏,而200mg/kg/d和400mg/kg/d TOCP处理组小鼠睾丸的曲细精管结构显著紊乱,其生精细胞脱落,同时睾丸系数降低(p<0.01;p<0.001)。2、CASA结果显示,TOCP可显著抑制慢性染毒小鼠的精子存活率和运动力,并有浓度依赖性。同样,精子体外孵育1h后发现,TOCP在一定程度上抑制精子的活率与运动力(p<0.05)。3、金霉素(CTC)精子染色结果表明,TOCP慢性染毒组的精子自发与P4诱发顶体反应发生率仅在400mg/kg/d组呈显著性差异(p<0.05)。TOCP体外孵育0.5mmol/L组不会影响精子自发顶体反应,但显著抑制P4诱发顶体反应率(p<0.05)。1mmol/L组则对自发和诱发顶体反应均有显著的抑制作用(p<0.05)。4、免疫蛋白印迹(Western Blot)检测结果显示,随着TOCP染毒剂量的增加,CatSper1、CatSper2、CatSper3、Slo3蛋白表达呈显著下降,而CatSper4蛋白表达仅在400mg/kg/d组呈表达差异。5、精子膜片钳电流检测结果显示,与对照组相比,TOCP染毒对小鼠精子ICatSper呈剂量依赖式抑制(p<0.001),在400mg/kg/d组甚至未检测出相关电流变化;而TOCP对IKsper亦呈浓度依赖式抑制(200mg/kg/d组p<0.01;400mg/kg/d组钾电流为0)。体外孵育实验显示,TOCP对ICatSper具有一定程度的抑制(1mmol/L组p<0.05),而对IKSper无明显影响。结论:1、增塑剂TOCP影响小鼠成熟精子生理功能。2、TOCP的精子功能损伤机制与精子特异性离子通道CatSper与Slo3的抑制有关。