【目的】肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是最常见的呼吸道感染病原菌之一,人群普遍易感。肺炎支原体是我国社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的首位致病菌[1,2],经常出现大规模暴发流行(平均每2-6年出现一次全球流行),近年来还出现越来越多的危重病例[3-5]。肺炎支原体的抗生素选择方案主要有三大类:大环内酯类、喹诺酮类和四环素类。大环内酯类作为首选抗生素,近年耐药率不断上升,我国以92%的耐药率高居世界之首[6]。如何预防肺炎支原体对其他两种抗生素产生耐药性变得极其重要。从2001年Okazaki N等人第一次公开报道肺炎支原体对大环内酯类耐药[7],到2009年我国出现92%耐药率的报道,中间仅仅相隔了不到十年的时间。虽然还没有肺炎支原体对喹诺酮临床耐药的报道,但在其他人类支原体中[8,9]已经分离到喹诺酮类的临床耐药株,国内外也都已有用喹诺酮类体外诱导肺炎支原体耐药成功的报道[10,11]。加之喹诺酮类因为其对骨骼发育的影响而禁用于18岁以下人群,四环素类成为8-18岁人群耐大环内酯类肺炎支原体感染的唯一选择。四环素目前在临床与体外均未出现过耐药的报道。本实验旨在收集临床样本,筛查临床对四环素耐药的肺炎支原体株,同时进行体外诱导耐药。通过对临床与诱导耐药两者耐药机制的探讨,对临床用药进行指导,避免或者延缓肺炎支原体对四环素类抗生素产生耐药。【方法】1.本课题组已在2010-2014年期间从某医院呼吸科门诊和病房从患者的呼吸道标本中培养和分离获得了数十株肺炎支原体株,建立了肺炎支原体菌株库,本实验从该菌株库中复苏肺炎支原体株;用肺炎支原体肉汤培养法与肺炎支原体琼脂培养法交替传代以获得纯化的肺炎支原体菌株。同时继续从临床收集咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道标本,用实时定量PCR与肉汤培养法继续鉴定、分离、培养新的肺炎支原体株。2.用96孔板肉汤微量稀释法对肺炎支原体进行药敏检测,若肺炎支原体对四环素类MIC≥8μg/m L时,判断为肺炎支原体对四环素类耐药。3.对敏感株进行诱导耐药,在含有低于抑菌浓度抗生素的培养基中逐代培养,直至肺炎支原体株产生耐药。4.对耐药株进行添加外排泵抑制剂利血平和碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)的药敏实验,观察外排泵抑制剂对MIC值的影响,排查耐药株中是否存在外排泵。5.对耐药株和敏感株进行全基因测序,筛查耐药株中是否含有核糖体保护蛋白基因、外排泵基因、灭活酶基因或其他耐药基因,并进行靶区(16S r RNA)序列的比对分析。6.核糖体与四环素结合力实验:用同位素H(氚)标记四环素,将同位素标记的四环素分别与敏感株和诱导耐药株(已验证16S r RNA靶位突变)的核糖体孵育结合,将孵育液滤过GF/C滤膜(Whatman),再用5 m L缓冲液洗膜3次,滤膜80℃烤干后置于1 m L闪烁液中过夜。使用液体闪烁计数仪(Tricarb 9100型,美国PE公司)测量CPM值(count per minute)。7.对敏感株与耐药株进行蛋白双向电泳,通过蛋白质组学的方法,寻找敏感株与耐药株间的差异蛋白,鉴定是否含有与四环素耐药相关的功能蛋白。【结果】1.共成功复苏33株肺炎支原体株,共收集临床样本132份,实时定量PCR检测肺炎支原体阳性样本12份(9.1%),但未从临床分离获得新的肺炎支原体株。2.药敏结果显示肺炎支原体对四环素类全部敏感,其中替加环素MIC值相对较低,显示出比一、二代四环素及喹诺酮类更好的抗菌活性,肺炎支原体对左氧氟沙星全部敏感,对红霉素耐药率54.8%。3.在含四环素类的培养基中持续传代,共获得8株对四环素类耐药(MIC≥8μg/m L)的诱导耐药株,所有经历过四环素类诱导的菌株,MIC值均较诱导前有显著升高,并且对其他四环素有交叉耐药。4.外排泵抑制剂利血平可以将部分菌株对四环素、米诺环素及替加环素的MIC值降低4倍以上,碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)对耐药株MIC值未发现明显类似作用。5.全基因组测序提示8株诱导耐药株中,6株存在16S r RNA 1173位点A→T突变;另外2株同时存在964位点T→C、1169位点G→A的点突变。所有的敏感株均未检测到以上位点的改变。以上位点的突变仅出现在耐药株中,且以上位点的突变位于四环素的结合靶区。另外,使用Res Finder2.1在全基因组序列中查找耐药基因,在所有诱导耐药株中均未发现核糖体保护蛋白基因、外排泵基因和灭活酶基因及其他与四环素耐药相关的耐药基因。6.靶位结合力实验显示,诱导耐药株的核糖体比敏感株核糖体对四环素的结合力明显减低。7.建立了用蛋白双向电泳对肺炎支原体蛋白质组进行研究的实验方法。在S63敏感株与诱导耐药株中共选取19个差异蛋白点进行鉴定,鉴定结果未发现与耐药直接相关的功能蛋白。但发现在耐药株中,与蛋白转录合成相关的蛋白(如分子伴侣蛋白、转录延长因子Gre A等)表达增多,在敏感株中,与能量代谢有关的蛋白(丙酮酸脱氢酶、烯醇酶等)表达增多。【结论】1.本研究未发现临床对四环素类耐药的肺炎支原体;2.四环素类药物可诱导肺炎支原体耐药,且可呈交叉耐药;3.首次获得8株对四环素类耐药的肺炎支原体的全基因序列并上传Genbank;4.诱导耐药株中尚未发现外排泵基因、核糖体保护基因和灭活酶基因;5.肺炎支原体对四环素类诱导耐药最有可能的机制是靶区突变;6.靶位结合力实验提示16S rRNA靶区点突变可以降低核糖体对四环素的结合力;7.诱导耐药株中未发现与四环素类耐药直接相关的功能蛋白。