磷脂酰肌醇3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)在囊泡运输,细胞器形成和自噬中起重要作用。III型磷脂酰肌醇-3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase,PI3KC3)可以催化磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)生成PI3P,通过PI3P募集其它膜蛋白,调控膜结构的延伸过程。目前已经在哺乳细胞中定义了两种III型磷脂酰肌醇-3-激酶复合物:包含Atg14的PI3KC3-C1和包含UVRAG的PI3KC3-C2。PI3KC3-C1对于自噬的发生十分重要,而PI3KC3-C2则参与多种膜泡运输过程。本研究主要集中于新近发现的PI3KC3-C1的第五个组分NRBF2,探索其对PI3KC3-C1的形成及活性影响。这将有可能精准的调控PI3KC3-C1的活性,从而达成对自噬的特异性调控。本课题组已发现NRBF2可能作为营养感受激酶mTORC1的底物,NRBF2会被mTORC1磷酸化。当NRBF2的磷酸化水平发生变化时,会改变PI3KC3-C1的组装方式,从而影响PI3KC3-C1的活性,但此研究尚缺乏体外实验基础。在本研究中,我们从哺乳细胞表达系统纯化不同组分的PI3KC3-C1(主要区别在NRBF2的磷酸化形式),并对不同组分的PI3KC3-C1进行了酶活性测定。实验结果显示五元的PI3KC3-C1表现出的酶活性高于四元的PI3KC3-C1,其中持续去磷酸化形式的NRBF2对PI3KC3-C1酶活的促进能力最强。这提示NRBF2可能具有促进自噬活性的功能,其中NRBF2的去磷酸化在其中发挥重要作用。我们又进一步探索了这一现象的可能机制,发现NRBF2的存在可能影响PI3KC3-C1的tethering能力,由此影响酶活。本研究建立了一种可靠的纯化PI3KC3-C1的方法,首次在体外验证包含去磷酸化NRBF2的PI3KC3-C1,酶活性最高,提示其可以作为后续自噬小分子抑制剂的靶标,为高通量筛选自噬特异性抑制剂研究提供基础。