背景鼻咽癌在中国是发病率仅次于甲状腺癌的头颈部恶性肿瘤,主要高发于中国华南以及东南亚等地区。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段及根治性治疗的重要组成部分。目前,鼻咽癌已取得较理想的生存预后,但临床上仍有超过五分之一的鼻咽癌患者经过规范治疗后出现复发或远处转移。放射抗拒被认为是鼻咽癌治疗后失败的主要原因,但目前放射抗拒的具体机制尚未十分明确。越来越多研究表明,肿瘤出现放射抗拒可能与肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)有关。CSCs是一组极少数的增殖性失控、能够自我更新、多向分化以及具有干细胞特性的肿瘤细胞,它们对放射治疗和其他肿瘤治疗方式存在抗拒性。以往有学者发现,通过分次照射的方法获得的放射抗拒食管癌细胞显示出CSC特性及高水平端粒酶活性。端粒酶是一种核糖核蛋白复合酶,参与了大约90%人类肿瘤的端粒维持机制。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是维持端粒酶活性的必要催化亚基,表达水平与端粒酶活性相一致。hTERT与端粒酶对于维持CSCs的生物学特性至关重要,也被认为参与调控肿瘤放射敏感性。我们前期研究发现,自主构建的放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R高表达被认为是潜在干性标记物的CD166蛋白。综上所述,我们也有理由推测CNE-2R细胞可能也具CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性及hTERT。迄今为止,国内外鲜有关于鼻咽癌放射抗拒细胞的CSC样特性及针对CSC特性改善其放射敏感性的研究报道。此外,鼻咽癌放射抗拒细胞是否具有高水平端粒酶活性以及高表达hTERT呢?若以hTERT作为干预靶点,能否调控CSC样特性从而改善放射抗拒性鼻咽癌的放射敏感性,其中是否还有更深层次的机制呢?综上所述,我们认为有必要进行深入探讨以验证提出的假说。目的本研究首先通过系列实验验证课题组前期构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R具有CSC样特性、高水平端粒酶活性及高表达hTERT;然后利用慢病毒介导的RNA干扰沉默CNE-2R细胞的hTERT表达,利用体外、体内试验观察CNE-2R细胞的CSC样特性及放射敏感性的变化;最后再进一步研究hTERT与CSC样特性之间可能存在的信号调节通路,明确hTERT如何调控CSC特性并最终影响CNE-2R细胞的放射敏感性。本研究的最终结果可能为寻找靶向杀伤CSCs的鼻咽癌放射增敏疗法寻找一些新思路。方法1.采用qPCR检测鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R与亲代放射敏感细胞株CNE-2的干细胞相关基因、β-catenin及hTERT基因的mRNA相对表达量;Western-Blot实验检测CNE-2R与CNE-2细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达情况;免疫细胞化学检测CNE-2R细胞与CNE-2细胞中的标记滞留细胞比例;PCR-ELISA法检测各组细胞端粒酶活性。流式细胞术检测CNE-2R细胞和CNE-2细胞的CD133表达率;免疫磁珠分选获得CNE-2R-CD133+细胞与CNE-2R-CD133-细胞,采用CCK8法、细胞成球实验以及裸鼠体内成瘤实验证实CNE-2R-CD133+细胞具有CSC特性。2.设计并包装hTERT基因的RNA干扰慢病毒载体,再将hTERT干扰慢病毒转染CNE-2R细胞获得hTERT-shRNA细胞,空载病毒感染CNE-2R细胞获得NC-shRNA细胞,然后通过流式细胞术检测感染率,利用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证沉默效果,最终构建稳定沉默hTERT的细胞株。3.利用PCR-ELISA检测CNE-2R细胞hTERT沉默前后的端粒酶活性。采用克隆形成实验、CCK-8实验及流式细胞术检测体外放射敏感性;接着构建裸鼠移植瘤模型,观察沉默hTERT对移植瘤放射敏感性的影响;采用Western-blot实验、免疫组织化学检测体外或体内的hTERT蛋白、干细胞相关蛋白及β-catenin蛋白的表达水平;利用TUNEL法检测移植瘤内的细胞凋亡指数。4.利用hTERT过表达慢病毒转染CNE-2R细胞,采用荧光定量PCR及Western-blot实验检测细胞转染后hTERT mRNA及蛋白的表达情况以验证过表达效果。用含有Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939和激动剂SKL2001 的培养基培养细胞。Western-blot 实验检测 hTERT、β-catenin及干细胞相关蛋白以了解hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的关系以及对干细胞相关蛋白表达的影响。细胞免疫荧光检测hTERT沉默或过表达后β-catenin蛋白在细胞核和细胞质的分布情况。免疫共沉淀实验检测hTERT与β-catenin蛋白是否存在直接相互作用。利用PCR-ELISA法检测各组细胞的端粒酶活性,CCK-8实验检测各组细胞的放射敏感性。结果1.CNE-2R细胞的干细胞相关基因及hTERT基因mRNA相对表达量均高于CNE-2细胞(P<0.05);同样,CNE-2R细胞的干细胞相关蛋白、β-catenin及hTERT蛋白表达量明显高于CNE-2细胞。CNE-2R细胞与CNE-2细胞的标记滞留细胞比例分别为(3.10±0.63%)vs(0.40±0.35%),P<0.001。CNE-2R细胞的端粒酶活性(1.618±0.022)显著高于CNE-2细胞(1.344±0.006),P<0.05。流式细胞术结果显示,CNE-2R细胞与CNE-2细胞的CD133阳性率分别为(2.49±0.56%)vs(0.76±0.25%),P=0.008;CNE-2R-CD133+细胞的体外增殖能力、体内成瘤能力以及端粒酶活性均显著高于CNE-2R-CD133-细胞及CNE-2R细胞(P<0.05)。2.流式细胞术结果显示,hTERT-shRNA细胞和NC-shRNA细胞的慢病毒感染率均达到90%以上。荧光定量PCR结果显示,hTERT-shRNA细胞的hTERT mRNA 相对表达量(0.164±0.023)明显低于 NC-shRNA 细胞(1.207士0.054)及 CNE-2R 细胞(1.000±0.041),P<0.001。Western-Blot 实验结果同样显示hTERT-shRNA细胞的hTERT蛋白表达明显下调。3.克隆形成实验结果显示,各照射剂量下hTERT-shRNA细胞的存活分数均低于CNE-2R及NC-shRNA细胞,hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞的放射增敏比为1.23>1,提示hTERT-shRNA细胞对射线更为敏感。CCK-8结果同样提示hTERT-shRNA细胞相对于CNE-2R细胞对射线更加敏感。流式细胞术检测结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA细胞的凋亡率稍微增加,CNE-2R细胞、NC-shRNA细胞及hTERT-shRNA细胞的凋亡率分别为(4.82±0.73%)vs(4.85±0.35%)vs(6.25±0.38%),P=0.023;4 Gy射线照射后,3组细胞的凋亡率分别为(12.10±1.14%)vs(12.71±0.74%)vs(19.03±0.43%),P<0.001;CNE-2R 细胞、NC-shRNA 细胞照射前后的凋亡率差异均无统计学意义(P>0.05)。PCR-ELISA结果显示,hTERT-shRNA细胞的端粒酶活性为(1.263±0.024),明显低于NC-shRNA细胞(1.629±0.007)及CNE-2R细胞(1.618±0.022),P<0.001。裸鼠移植瘤模型结果显示,OGy射线照射时,hTERT-shRNA组移植瘤生长受到轻微抑制;8Gy射线照射后,3组移植瘤生长速度均受到抑制,但hTERT-shRNA组抑制程度更加明显。TUNEL法检测各组移植瘤的体内细胞凋亡指数,结果与体外细胞凋亡率基本一致。Western-blot实验及免疫组化结果均显示,沉默hTERT后,体外及体内的干细胞相关蛋白表达水平均明显下调;免疫组化结果还发现,hTERT-shRNA组移植瘤的β-catenin蛋白主要表达于细胞膜与细胞质,而CNE-2R及NC组移植瘤的部分细胞核内也可见表达。4.Western-blot实验结果显示,hTERT正调节干细胞相关蛋白的表达,但未能明显影响Wnt3a及总β-catenin蛋白的表达;进一步检测发现,沉默hTERT后核内β-catenin蛋白显著减少,过表达hTERT后核β-catenin蛋白显著增多;抑制或激活Wnt/β-catenin信号通路后可正调节hTERT及干细胞相关蛋白的表达。免疫共沉淀可检测到CNE-2R细胞中存在着β-catenin/hTERT蛋白复合物,表明β-catenin与hTERT蛋白存在直接相互作用。PCR-ELISA结果显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能降低CNE-2R细胞的端粒酶活性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转端粒酶活性。CCK8实验结果同样显示,沉默hTERT或抑制Wnt/β-catenin信号通路均能增加CNE-2R细胞的放射敏感性;而当抑制Wnt/β-catenin信号通路后,可通过过表达hTERT逆转细胞的放射抗拒性。结论本研究首先证实了课题组前期通过分割照射构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R表现出CSC样特性并表达高水平的端粒酶活性以及hTERT。然后通过慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建了稳定沉默hTERT的CNE-2R细胞株,结果发现沉默hTERT后可在体外及体内增强CNE-2R细胞的放射敏感性,同时下调CNE-2R细胞的端粒酶活性并抑制其CSC样特性。我们进一步研究发现,在CNE-2R细胞中存在hTERT与Wnt/β-catenin信号通路的正反馈环并调控CNE-2R细胞的端粒酶活性及CSC样特性,从而对CNE-2R细胞的放射敏感性起到调节作用。因此,干扰hTERT表达和阻断Wnt/β-catenin信号转导可能是一种靶向杀伤具有CSC样特性的放射抗拒性鼻咽癌细胞的有前景策略,这将为研究放射抗拒鼻咽癌的放疗增敏疗法提供了新的思路。