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益生菌在调节胃肠道微生态平衡、增强机体抗氧化能力、调节机体免疫力和延缓衰老等方面有特殊生理活性。中国长寿地区分布广,益生菌资源丰富,然而特色菌种的挖掘利用匮乏,益生菌延缓衰老的分子机制鲜有探究。湖南省浏阳市高田村居民寿命90岁以上较为常见,远高于中国人均预期寿命,迄今尚无对该地区居民长寿原因的研究。为此,本文在系统分析浏阳高田村居民肠道菌群结构的基础上,分离筛选出乳酸菌菌株,重点对一株植物乳杆菌的益生功能进行了评价,对其抗氧化、保护肠屏障和延缓机体衰老的分子机制进行了初步探究。通过对高田村长寿老人粪便微生物菌群结构的分析,发现其菌群多样性高于其他地区人群,且高田村居民肠道菌群相似性较高。高田村居民肠道微生物含有特有248个OTU,远高于对照组的60个,其包括甲烷细菌属(Methanobacterium)等特殊菌属,进一步用RT-q PCR证实了高通量测序的结果,高田村居民的乳酸菌丰度比对照组高40余倍。采用传统微生物分离方法从21名长寿老人肠道菌群中获得90株菌,分别为:15株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),25株发酵乳杆菌(L.fermentum),32株粘膜乳杆菌(L.mucosae),16株唾液乳杆菌(L.salivarius),1株海氏肠球菌(Enterococcus hirae)和1株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。经过耐受过氧化氢,模拟胃液和肠液以及清除自由基能力评价,筛选出三株性能优良菌株:植物乳杆菌FLPL05、FLPL0302和FLPL0902,用于衰老模型小鼠的干预研究。采用D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型评价上述植物乳杆菌的安全性和益生性。结果发现,植物乳杆菌FLPL05对肝功能具有保护作用,显著降低了血清中谷丙转氨酶(ALT)(P<0.05)和谷草转氨酶(AST)水平(P<0.01),对血糖血脂和肾功能无显著影响(P>0.05)。体内抗氧化能力结果表明,植物乳杆菌FLPL05显著提高了血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)(P<0.05)和肝脏总超氧化物酶(T-SOD)(P<0.001)的活性,降低血清丙二醛(MDA)水平(P<0.05),上调小肠的抗氧化基因(MT1,MT2,GPx1和GPx2)转录水平。共孵育后,植物乳杆菌FLPL05显著上调了HT-29细胞的PRG1、MT1A、MT1M和BCL2基因转录水平,Caco-2细胞的PRG1、GPX2、MT1A、MT1M和BCL2基因转录水平。进一步采用自然衰老小鼠为模型,比较植物乳杆菌FLPL05和FLPL0302延长寿命,调节肠道菌群的能力。结果表明,长期饲喂植物乳杆菌FLPL05,显著延长了小鼠30%的平均寿命。菌群多样性分析结果表明,植物乳杆菌FLPL05干预后,小鼠肠道菌群在门水平表现为:厚壁菌门增多、拟杆菌门减少;在属水平,乳杆菌属(Lactobacillus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和阿克曼氏菌属(Akkermansia)比例增多,费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、梭菌属(Clostridium)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)减少。为阐释植物乳杆菌FLPL05延缓小鼠衰老,促进健康的作用,采用蛋白组学技术对小鼠肠道表达蛋白进行了解析。结果表明,植物乳杆菌FLPL05干预后肠道共有197个蛋白上调表达,124个蛋白下调表达。GO数据库的功能归类和分析表明,这些蛋白共参与25类生物学过程1982条款,16类细胞组成365条款,12类分子功能341条款,功能主要涉及氧化还原酶类、生物调节、粘附功能、代谢过程、突触、对刺激的反应、生物过程调节及调控、细胞的紧密连接和钙黏素等。表达的差异蛋白通过KEGG数据库分析显示,参与236条信号通路,涉及免疫系统、运输和分解代谢等通路。体内实验证实,植物乳杆菌FLPL05降低了衰老所致的炎症水平升高、抑制了肠道通透性增大的发生,通过上调ZO-1、claudin-4和occludin等紧密连接蛋白的表达,减少肠道内的凋亡细胞,维持了肠道粘膜屏障的完整性,从而保障衰老后的机体健康。荧光定量RT-q PCR结果显示,植物乳杆菌FLPL05上调了抗氧化基因和端粒酶逆转录基因的转录表达。植物乳杆菌FLPL05延缓衰老、保护肠道屏障完整性有其遗传背景。全基因组测序、生物信息分析结果表明,植物乳杆菌FLPL05两个抗氧化系统(硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统)有助于其应对过氧化氢的胁迫;包含22个相关基因的完整植物乳杆菌素基因簇,有助于其拮抗致病菌,保护肠道屏障。通过与植物乳杆菌ATCC14917、ATCC8014和WCFS1比较基因组发现,植物乳杆菌FLPL05具有287个特有基因,其中229个基因功能未知,其仅有58个基因注释到功能,包括胞外多糖合成基因,肽类的转运蛋白和CRISPR-Cas系统相关基因等。综上所述,本文采用高通量测序技术分析了长寿老人肠道菌群的结构,分离筛选出有益生功能的植物乳杆菌FLPL05,对其延缓衰老的作用机制进行了探究。本文为挖掘中国特色益生菌菌种资源,探究其益生机制提供了思路和方法,从而为益生菌的应用奠定了技术基础。