目的：　　 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，根据近年的统计，美国女性新发肿瘤中，乳腺癌占据首位。在发达国家其发病率随着年龄的增长而增加。在过去十年里中国的乳腺癌发病率稳步增加且更年轻。目前外科切除或联合系统化疗对乳腺癌患者是有效的，但效果并不满意。化疗是肿瘤综合疗法的方法之一，广泛用于术前、术中及术后。当乳腺癌发生转移时其治疗特别困难。恶性肿瘤的基因治疗是一种有可能根治恶性肿瘤而不损伤正常组织的特殊治疗手段。1986年Frederid Moolten首次描述了自杀基因疗法，现在已发展为重要的且最具潜力的肿瘤新兴治疗方法之一。通过rAAV/TRE/HSV-TK/GCV/DOX阿霉素系统联合化疗药物治疗乳腺癌体内外实验结果显示，这种带有靶向TRE(tetracycline-responsive element)启动子的载体系统联合适当的化疗比单用其中任何一种疗法的疗效更好，自杀基因可能对乳腺癌产生很好的杀伤效果。　　 在自杀基因疗法中，将某些病毒、细菌中特有的前药物转换酶基因-通过病毒等载体导入肿瘤细胞，自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物达到杀死肿瘤细胞的目的。目前基因治疗系统有多种，应用于实体肿瘤治疗研究较多的有：单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-TK/GCV)系统、细菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶/5-(2-溴乙烯)-2-脱氧尿苷(VZV-TK/BVDU)系统，而单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-TK/GCV)系统目前应用较为广泛。GCV本身无毒性，是一种核苷酸类似物，在TK作用下形成GCV单磷酸盐(GCV-MP)，然后在细胞内再转化为三磷酸盐(GCV-TP)的形式，作为链终止剂，阻止单链DNA延长，使细胞周期停滞在S期，抑制细胞分裂并使其死亡，GCV-TP对增殖中的哺乳细胞具有高度毒性。哺乳动物细胞自身的胸腺嘧啶激酶可以催化GCV的转化，而HSV-TK的作用更强，超过前者200倍。自杀基因对包括肝癌、乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑胶质瘤及卵巢癌的治疗效率已被许多肿瘤的细胞实验和动物实验证实。尽管自杀基因的治疗效果在基础实验中被肯定，但在临床上的应用仍存在杀伤效率有限及安全使用问题。从临床应用安全角度考虑，理想的肿瘤自杀基因治疗即要有效性，又要安全性，而安全性的关键在于其真正做到靶向性表达，从而杀灭肿瘤细胞，又使正常组织免于受到损伤。E1B55Kda蛋白和p53蛋白调控腺病毒在宿主细胞中的复制，其主要机制是病毒在宿主细胞的复制被p53蛋白抑制，而宿主细胞p53被E1B55K蛋白抑制，从而使腺病毒的复制能够在宿主细胞中顺利进行。具有靶向瘤裂解功能的腺病毒ONYX-015(d11520)是一种E1B55K基因缺失的腺病毒，由于不能表达E1B55Kda蛋白，从而使p53蛋白功能不能被抑制，因此在p53功能正常的细胞中不能复制，但在p53功能缺陷的肿瘤细胞中其可以复制。因此理想载体的选择对治疗基因能否安全、高效地导入肿瘤细胞是肿瘤基因治疗成功极为重要的一环。　　 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表达于细胞永生化过程中具有端粒酶活性的细胞中，绝大多数人恶性肿瘤细胞中端粒酶活化而正常体细胞检测不到。缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)启动子的活化是实体肿瘤特异性的改变，可以使得外源基因在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞内表达量极微，据此可以作为肿瘤特异性的靶向启动子。　　 选择复制型腺病毒SG500中早期转录单位E1A和E1B区之前分别加上了hTERT和HRE(hypoxia response element缺氧反应元件)，且SG500与ONYX-015相似，能在p53功能缺失的肿瘤细胞中复制，并将后者杀死；而SG500含有克隆位点可以插入外源基因而成为SG500-gene，而ONYX-015无克隆位点。因此SG500做为载体能够使外源基因靶向的在肿瘤细胞中转录，实现了多重靶向。　　 Dm-dNK(multisubstrate deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster)基因即黑腹果蝇多底物脱氧核苷酸激酶基因是一种新的自杀基因。Munch-Petersen等从果蝇身上提纯了这种基因表达的激酶，并发现它能够催化自然界所有嘌呤、嘧啶脱氧核糖核酸的磷酸化反应，具有广泛的底物特异性，还表现出惊人的催化效率，高出目前了解的核酸激酶效率的10-100倍，这种特殊性使其成为激酶家族的独特成员。Zheng等对其是否可以用做分子化疗的基因做了评估，发现它产生的激酶能对某些抗病毒或抗肿瘤药物，如核苷酸类似物(nucleoside analog)，起到有效的磷酸化作用。研究者使Dm-dNK在癌细胞种系中表达并且起到一种自杀基因的作用，成功证明了这种酶在癌细胞表达的可能性以及其在癌细胞中仍然保持着较高的酶活性，不仅如此Dm-dNK还增加了癌细胞对某些化疗药物的敏感性。有研究显示突变可以提高自杀基因Dm-dNK的酶活性，从而更高效杀伤细胞。　　 我们在果蝇多底物脱氧核糖核苷酸激酶氨基酸序列中最后10位予以随机突变，突变后的氨基酸分别为第244位谷氨酸、245位丝氨酸、251位丝氨酸、252位苏氨酸，形成一个突变型果蝇多底物脱氧核苷酸激酶(Dm-dNKmu)。利用选择复制型腺病毒SG500做为载体将突变型多底物脱氧核糖核苷酸激酶(Dm-dNKmu)基因导入乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7加入不同浓度的不同核苷类药物作用肿瘤细胞。并运用RT-PCR、酶活性测定分析其表达产物，运用MTT、CPE及病毒增殖实验在不同水平检验SG500-CMV-Dm-dNKmu对肿瘤细胞的杀伤效果及其安全性。进而做荷瘤小鼠的体内试验，观察SG500-CMV-Dm-dNKmu联合核苷酸类似物在动物实验中的安全性和敏感性。探讨这种治疗体系对于乳腺癌细胞杀伤作用，为治疗乳腺癌提供新思路。　　 方法：　　 一、选择复制型腺病毒载体质粒SG500-CMV-dNKmu构建及转染　　 pENTR-12载体在CMV启动子与加尾信号之间含有多克隆位点，HindⅢ、EcoRI、EcoRV、Xbal、XhoI、BamHI。通过基因操作方法将肿瘤治疗基因Dm-dNKmu，顺向插入到pENTR-12的多克隆位点，构建成PENTR12-Dm-dNKmu质粒。该质粒与PPE3-ccdB重组，用Lipofectamine2000将PPE3-CMV-DNKmu质粒与SG502共转染至293细胞，9-14天出现病毒空斑，应用QIAGEN DNA BloodMini Kit提取腺病毒DNA，通过PCR验证后命名为SG500-CMV-DNKmu，即CMV调控的带DNKmu基因的E1B55kDa基因缺失的肿瘤特异性增殖型腺病毒。复制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比较不同细胞系间感染率的区别。　　 二、酶活性测定　　 通过提取细胞的蛋白，用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物，混合液在Whatman DE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。　　 三、Dm-dNKmu基因的表达　　 用TRIZOL方法提取纯化SG500-CMV-DNKmu病毒感染后的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7；人胚肺成纤维上皮细胞株MRC-5、WI38，使用反转录PCR试剂盒对目的基因的表达进行检测。　　 四、SG500-CMV-dNKmu联合核苷酸类似物在体外对乳腺癌细胞的杀伤作用　　 人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和正常细胞WI-38、MRC-5铺96孔板，培养基在第二天分别替换为病毒溶液SG500-CMV-dNKmu和SG500，感染72h后分别加前药dFdC和BVDU浓度梯度为0.1μM至100μM，加药后4天结束实验，采用MTT法检测细胞增殖情况。每个实验至少做三次　　 采用Annexin V-FITC双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常细胞MRC-5细胞铺6孔板分别感染病毒SG500-CMV-dNKmu，SG500加入核苷酸药物dFdC和BVDU处理，经AnnexinV-FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。　　 五、SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc或Bvdu抑制腺病毒增殖　　 取对数生长期的MDA-MB-231、MCF7、WI-38、MRC-5细胞，接种于24孔培养板中，按MOI=1加入病毒，设SG500-CMV-dNKmu组、SG500组。24h后加入前药dFdC、BVDU浓度为(10μM)感染后收集病毒感染96h的细胞及上清液，-80℃冻融三次；离心，取上清，收获病毒。利用肾成纤维细胞293通过TCID50(tissue culture infectious dose)方法检测病毒滴度在药物处理前后的变化。　　 同样细胞经过病毒及药物的干预方法如上，利用细胞裂解液提取细胞蛋白，通过Western Blot蛋白杂交法检测病毒早期转录单位蛋白EIA在治疗前后的变化。　　 六、SG500-CMV-DNKmu联合Dfdc对裸鼠移植瘤的抑制作用　　 取30只BaIb/c裸小鼠，右侧腋下接种生长良好的MDA-MB-231细胞悬液。待长出50-100mm3直径的肿瘤后(一周左右)，随机分为3组，实验组10只：瘤体内注射SG500-CMV-dNKmu，隔天注射1次，注射10天后，第2-10天腹腔注射DFDC1mg/kg/d。对照组20只：10只注射SG500-CMV-dNKmu同实验组，第2-10天腹腔注射PBS共注射9次；10只瘤体内注射PBS，方法同实验组观察裸鼠生存及肿瘤大小，用游标卡尺测量肿瘤短径(a)、长径(b)，按公式V=ab2/2计算肿瘤体积，按下式计算抑瘤率：抑瘤率=[(对照组肿瘤的平均体积-实验组肿瘤的平均体积)/对照组肿瘤的平均体积]×100％，并通过免疫组织化学法检测早期转录单位EIA表达。　　 结果：　　 一、选择复制型腺病毒载体质粒SG500-CMV-dNKmu构建及转染：　　 通过基因操作方法将肿瘤治疗基因Dm-dNKmu，顺向插入到pENTR-12的多克隆位点，构建成PENTR12-Dm-dNKmu质粒。该质粒与PPE3-ccdB重组，用Lipofectamine2000将PPE3-CMV-DNKmu质粒与SG502共转染至293细胞，应用PCR进行鉴定。电泳证实CMV启动子长度为521bp，Dm-dNKmu序列长度为779bp。由表达绿色荧光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)感染来确定病毒对细胞系的感染率。结果乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7正常细胞系WI-38、MRC-5表现出基本相同的感染率。　　 二、Dm-dNK基因的表达及酶活性的检测　　 重组腺病毒SG500-CMV-dNKmu感染细胞后的激酶活性检测结果，感染后的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7酶活性明显高于没有感染病毒的乳腺癌空白细胞系，分别高29倍和21倍，高出重组腺病毒SG500-CMV-dNKmu感染正常细胞MRC-5、WI38酶活性的近10倍。RT-PCR检测发现，重组腺病毒SG500-CMV dNKmu乳腺癌细胞Dm-dNKmu基因高表达，在正常细胞低表达。　　 三、Dm-dNKmu基因联合核苷类似物对乳腺癌细胞的杀伤作用　　 通过MTT及流式细胞仪检测凋亡的体外实验证实SG500-CMV-dNKmu对乳腺癌细胞选择性杀伤作用。MTT结果显示：SG500-CMV-dNKmu病毒和SG500病毒分别感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常细胞系MRC-5，WI-38，SG500-CMV-dNKmu与SG500相比，前者联合Bvdu或Dfdc更能有效的杀伤乳腺癌细胞(p<0.05)，然而在正常细胞中，SG500-CMV-dNKmu与SG500相比，二者联合Bvdu或Dfdc对正常细胞MRC-5，WI-38杀伤效果无差异(p>0.05)。而且Dfdc比Bvdu对Dm-dNKmu的底物特异性更高。AnnexinV-PI双染流式细胞仪分析发现，SG500-CMV-dNKmu感染后分别加Dfdc和Bvdu能够诱导近73%和61%的乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡，而对正常细胞MRC-5影响轻微，对照空载病毒SG500联合Dfdc和Bvdu杀伤效果小。　　 四、SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc或Bvdu抑制腺病毒增殖　　 TCID50方法检测病毒SG500-CMV-dNKmu、SG500、d11520和WtAd感染后的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常细胞系MRC-5，WI-38，加入不同化疗药物Dfdc和Bvdu，收集加药后的细胞及上清检测病毒滴度变化，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7中，SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc和Bvdu治疗病毒滴度均下降，而Dfdc下降最为明显，其他病毒没有发现上述现象。Western Blot方法对病毒早期转录单位E1A的检测也证实了这一点，由于SG500-CMV-dNKmu的选择性表达，SG500-CMV-dNKmu感染后E1A仅在乳腺癌细胞中表达，SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc和Bvdu使E1A表达明显降低，而正常细胞中，SG500-CMV-dNKmu的E1A表达并不明显。　　 五、Dm-dNKmu基因联合核苷类似物对裸鼠移植瘤的抑制作用　　 SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc对裸鼠MDA-MB-231乳腺癌细胞转移瘤治疗。注射PBS的对照组肿瘤体积明显增大，而注射腺病毒SG500-CMV-dNKmu组，尤其是SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc处理组肿瘤增长得到明显抑制。体内试验结果与体外实验相吻合。然而SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc处理组与以上两组相比，瘤体生长在治疗21天后明显被抑制(P<0.05)。　　 六、SG500-CMV-DNKmu联合Dfdc延长移植瘤裸鼠生存期　　 SG500-CMV-dNKmu/Dfdc系统对转有DM-dNKmu的乳腺癌MDA-MB-231细胞转移瘤治疗后裸鼠的生存期较MDA-MB-231转移瘤PBS处理组，MDA-MB-231转移瘤SG500-CMV-dNKmu处理组延长。　　 结论：　　 1.选择复制型腺病毒SG500能在体外成功感染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7，且具有较高的转染效率。SG500载体在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7中的复制具有肿瘤特异性，这可能跟人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7端粒酶活化或p53功能缺失有关。SG500载体能够在肿瘤的基因治疗中安全、高效的使用。　　 2.Dm-dNKmu激酶基因可以在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7中高水平表达，并仍能保持高的蛋白激酶活性。　　 3.SG500-CMV-dNKmu联合Dfdc或Bvdu对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7具有明显的生长抑制作用，且具有时间-剂量依赖关系。并且溶瘤腺病毒SG500-CMV-dNKmu对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7的生长抑制作用是通过诱导细胞凋亡来实现。　　 4.SG500-CMV-dNKmu与Dfdc或Bvdu联合使用，可以提高自杀基因对乳腺癌细胞的靶向性选择，由于自杀基因高效的催化活性，可以克服传统化疗毒副作用大的缺点，增强治疗效果。自杀基因磷酸化Dfdc或Bvdu后限制病毒的播散，有望解决病毒使用安全性问题。　　 5.在裸鼠体内移植瘤实验中，SG500-CMV-dNKmu/Dfdc治疗组有效抑制了裸鼠乳腺癌移植瘤的生长，同时延长裸鼠生存期。dNKmu磷酸化Dfdc后控制了病毒的复制，保证了病毒载体的安全使用。