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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪气喘病(MycoplasmaPneumoniae of swine,MPS)的病原。MPS广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其他致病菌的感染,给养猪业造成巨大的经济损失。该病早期检测比较困难以及缺乏特效的防治药物,因此在疾病控制方面至今未能取得令人满意的效果。伴侣蛋白Dnak是猪肺炎支原体的特异性外膜蛋白,伴侣蛋白Dnak的C端是其主要的抗原决定簇。P97蛋白是目前研究最为深入的Mhp表面的黏附因子,P97蛋白的C端也是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的232株基因序列(AE017332),以Mhp中国分离株Yin-1为模板利用合成的特异性引物,扩增了DnaK基因的C末端,得到500bp的目的片段。扩增了P97基因的C末端,得到670bp的目的片段。并将PCR产物分别克隆到pET-30a载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后,并送测序。测序结果与GenBank公布的标准株yin-1株的DNA同源性为99%以上。鉴定阳性的重组质粒转化到大肠杆菌(DE3)中进行原核表达。获得的重组蛋白分别命名为30a-DnakC-P97C和30a-P97C。经超声裂解,SDS-PAGE分析,重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,分别在57kD和36kD处分别获得特异性条带。经Western-blot抗原性分析,均具有较好的免疫原性。利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白30a-DnakC-P97C和30a-P97C进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以30a-DnakC-P97C作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,每只每次50μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,3d后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以纯化30a-P97C作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法三次亚克隆后,获得两株针对P97的能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A3C9和B4D5。生物学特性鉴定表明,腹水单抗A3C9和B4D5的间接ELISA效价分别为1∶10~5和1∶10~6,亚型鉴定分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,针对P97的两株单抗识别的不是同一抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性地与猪肺支原体Yin-1株97KD左右的抗原成分发生反应。而与其他相关支原体:丝状支原体丝状亚种SC型标准株(PGI)、丝状支原体丝状亚种LC型标准株(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、猪鼻支原体(Mh)无交叉反应,表明单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的单抗为更深入的分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。