目的:糖尿病肾疾病(diabetic kidney disease,DKD)是常见的糖尿病微血管并发症,也是引起终末期慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因。肾小管损伤是糖尿病肾疾病进程中的重要病理变化。关于预防和延缓糖尿病肾疾病的发生发展,保护肾功能,治疗糖尿病肾疾病等方面仍然需要进一步的研究。已有研究证实,糖尿病时,肾脏中存在大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)蓄积,破坏肾脏氧化还原的动态平衡,造成肾组织处于氧化应激状态,从而引起肾损伤的发生发展。体内存在多种抗氧化系统清除ROS,如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶及维生素C等可修复氧化损伤。阻止ROS的过量蓄积已成为治疗糖尿病肾疾病的有效途径。硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)系统在对抗氧化应激方面起重要作用。TRX是一种巯基-氧化还原酶,能够还原被氧化的蛋白,同时其自身的半胱氨酸残基被氧化,此后,TRX又被NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶催化还原。这种作用维持细胞内蛋白质的还原状态使其发挥正常功能。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein,TXNIP)又称硫氧还蛋白结合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2,TBP-2)和维生素D3上调蛋白1(vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1)。TXNIP是TRX的内源性抑制蛋白,TXNIP与TRX活性位点结合而抑制TRX活性,间接调控细胞氧化还原状态并且可诱导氧化应激的产生。许多研究表明,TXNIP在糖尿病相关模型中表达均明显升高。敲低或敲除TXNIP可抑制糖尿病并发症的发生发展。TXNIP在葡萄糖诱导胰岛β细胞凋亡的过程中发挥重要作用。敲低TXNIP表达能够抑制高糖诱导的胰岛β细胞的凋亡。我们前期研究显示:高糖能够诱导小鼠系膜细胞和肾小管细胞中TXNIP m RNA和蛋白表达水平均明显升高,并且p38 MAPK信号通路参与了此过程;敲低TXNIP表达能够增加高糖条件下细胞TRX活性和减少细胞内ROS含量,同时抑制p38 MAPK和ERK1/2等信号的激活。以上研究提示:TXNIP可能在DKD发病过程中发挥一定作用。在本研究中我们采用野生型C57BL/6(Wild type,WT)小鼠和TXNIP基因敲除鼠(TXNIP knockout,TKO)进行实验,利用STZ诱导小鼠糖尿病模型,观察了TXNIP在糖尿病肾脏损伤中的作用以及作用机制,验证TXNIP能否成为糖尿病肾疾病治疗的新靶点。方法:动物实验6~8周龄雄性WT小鼠(C57BL/6)和TKO小鼠(C57BL/6背景)随机分为四组:WT对照组、WT+DM模型组、TKO+DM模型组、TKO对照组,每组8只。糖尿病模型建立采用多次小剂量STZ(50 mg/kg,溶于p H 4.5柠檬酸缓冲液)腹腔注射诱导建立小鼠Ⅰ型糖尿病模型。给药前小鼠禁食12小时,连续给药5天。给药3天后测血糖,凡全血血糖≥16.7mmol/L,尿糖++~+++者确定为糖尿病模型。实验期间两周检测一次血糖、体重。于造模成功后24周进行取材,收集血液及24小时尿液,用于生化指标检测。小鼠称重后进行取材,取部分肾组织放于4%多聚甲醛溶液中固定,用于组织切片制作,进行常规病理学观察,免疫组织化学染色,免疫荧光染色和TUNEL染色检测。取部分肾皮质组织置于2.5%戊二醛固定,用于电子显微镜观察。取部分肾皮质组织置于液氮用于提取总RNA和总蛋白,观察肾皮质中相关检测指标的m RNA和蛋白表达水平。结果:1敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾组织TXNIP的影响。与WT对照组相比,DM组小鼠肾组织中TXNIP表达明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组和TKO组小鼠肾脏中TXNIP表达缺失,这说明TXNIP敲除成功并且TXNIP敲除可改善糖尿病诱导的TXNIP过度表达。2敲除TXNIP改善糖尿病小鼠的一般情况。通过检测与糖尿病肾病相关的常用生化指标显示:与WT对照组相比,WT+DM小鼠体重减轻,血糖和24h尿蛋白高于正常。TXNIP敲除对DM小鼠的上述指标有所改善。3敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾脏病理变化的影响。肾小球光镜PAS染色和MASSON染色发现,与WT对照组相比,WT+DM组系膜区明显增宽,细胞外基质增多,部分肾小球毛细血管腔扩张。敲除TXNIP基因能够改善上述糖尿病引起的肾病变。电镜观察显示:WT+DM组肾小球部分足突融合消失,基底膜不规则增厚,系膜区增宽。与对照相比,ColI在WT+DM组肾小球表达明显增高,TXNIP敲除能够改善糖尿病诱导的ColI过度表达。4敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾脏凋亡及凋亡相关指标的影响。TUNEL法检测结果显示:与WT对照组相比,WT+DM组小鼠肾组织细胞凋亡数量明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组肾组织细胞凋亡数量明显减少。与WT对照组相比,WT+DM组小鼠肾组织中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3水平明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase3明显降低,这说明TXNIP敲除可以改善DM小鼠肾脏细胞的凋亡。5敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾组织α-SMA表达的影响。与WT对照组相比,WT+DM组小鼠肾组织中α-SMA表达明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组小鼠中α-SMA表达明显降低,这说明TXNIP敲除可以明显降低DM小鼠肾脏中α-SMA水平。6敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾脏氧化应激的影响。与WT对照组相比,WT+DM组小鼠肾组织中Nox4和尿中8-OHd G表达明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组肾组织中Nox4和尿中8-OHd G表达明显降低,这说明TXNIP敲除可以明显降低DM小鼠肾脏中氧化应激水平。7敲除TXNIP对糖尿病小鼠肾脏p38 MAPK和ERK1/2信号通路激活的影响。与WT对照组相比,WT+DM组小鼠肾组织中p38 MAPK和ERK1/2磷酸化水平明显增高;与WT+DM组比较,TKO+DM组小鼠肾组织中p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平明显降低。结论:1、在糖尿病小鼠肾脏中TXNIP表达明显增加。2、敲除TXNIP能够保护糖尿病小鼠肾功能,改善肾脏肥大和肾小管间质纤维化。3、敲除TXNIP能够抑制糖尿病肾脏细胞凋亡以及调控凋亡相关指标的表达。4、敲除TXNIP能够抑制糖尿病肾脏p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化。5、敲除TXNIP对糖尿病肾疾病的保护作用可能是通过减少氧化应激实现的。