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能量和营养元素是浮游植物生长所必需的。其中能量源自太阳光光能。光合作用是光能固定最重要的机制。生物通过光合作用将环境中的二氧化碳固定到体内转化为有机物实现能量的储存,RuBisCO是这一过程中最重要的酶。视紫红质Rhodopsin基因是近年来新发现的光能捕获基因。生物可以通过该基因捕获光能并在细胞膜内外建立质子梯度进而合成ATP,更高效的转化光能。磷营养盐既是海洋浮游植物生长所必须的营养成分,又是生物体内重要的能量传递物质。是海洋生态系统中浮游植物地化过程的主要驱动者。研究浮游植物光能固定基因的表达调控以及对磷营养盐限制的应对策略有助于深入了解浮游植物对环境因子变动的响应以及赤潮藻爆发式增长、生消和演替过程。 东海原甲藻在我国东海每年形成赤潮,造成严重的海洋生态灾害和经济损失。本研究以东海原甲藻为目标藻种进行了以下研究: 1、分离得到了东海原甲藻的RuBisCO基因并且调查了这个基因的昼夜表达模式以及调控机制。我们的结果显示该基因由3个前后重复的编码区表达单元串联而成,5末端具有一个典型的甲藻质体基因转运肽,这个转运肽由3部分组成,其中包括两端的两个跨膜区域和中间的质体转运肽区域。转运肽的这种结构能够引导该蛋白进入由两层膜包被的甲藻叶绿体从而行使生物功能。基因的每个串联重复序列由1455bp核苷酸组成,最后一个重复序列长度为1464bp。串联的重复序列之间由63bp的间隔序列分开。进化分析的结果显示东海原甲藻重复的编码蛋白聚成单独的一簇,这表明该基因在完成了基因水平转移后才发生的基因复制。实时定量PCR的结果显示每个东海原甲藻细胞中含有117±40个编码区域。对同步化后的藻细胞昼夜表达模式研究显示该基因有着明显的昼夜表达规律性,在持续黑暗条件下细胞一直处于G1时期。结合流式细胞分析获得的不同时间点的细胞周期数据,我们认为该基因的表达和昼夜转换以及细胞G2M细胞周期相关。综上实验结果我们认为:(1)东海原甲藻的RuBisCO基因复制时间发生在基因水平转移以后;(2)该基因由前后重复的编码序列组成,这些串联重复序列同时转录、共同翻译并且由同一个转运肽引导到叶绿体中;(3)该基因的表达受到细胞周期的调控。 2、克隆了东海原甲藻的视紫红质基因(Pdrhod),并研究了该基因在甲藻中的结构、功能以及表达调控机制。序列分析表明该基因具有视紫红质基因典型的7个跨膜区域的保守结构。该基因的进化分析表明Pdrhod和其它发现的甲藻视紫红质基因可以聚为一类,属于Xanthorhodopsin分支。荧光定量PCR分析结果表明在正常的培养条件下(light/dark=14∶10,100μE·m-2·s-1),该基因的表达模式表现为明显的昼夜节律性,其中光周期表达水平比较高,暗周期表达水平比较低。该蛋白的免疫印迹杂交结果和该基因在RNA水平表达情况一致。对该基因在不同光照条件下转录及翻译水平的调控机制研究结果表明其在中等强度的光照以及蓝绿光谱中表达量最高。结合东海原甲藻在赤潮爆发时的孕育的条件推论该基因在较为浑浊的中层水域为东海原甲藻提供了捕获光能的分子基础,使其在赤潮爆发孕育阶段获取生态位优势。 3、对磷充足和磷限制条件下的东海原甲藻的生理及转录水平的差异做了分析和研究。生理学研究结果表明在磷限制条件下,东海原甲藻的表现为生长受抑、细胞增大等现象。转录组的基因注释显示东海原甲藻有多种利用有机磷的机制,其中包括碱性磷酸酶(AP)基因、5-核苷酸酶基因、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因等。在转录组中发现了高亲和磷转运蛋白和低亲和磷转运蛋白,说明东海原甲藻在吸收磷营养盐方面有多种策略。磷充足和磷限制条件下的基因差异表达分析获得1270个表达水平差异两倍及以上且差异显著(p<0.05)的基因,其中包括499个上调基因和781个下调基因。和磷充足条件相比,磷限制条件下表达更多的有机磷利用基因、碳固定相关的基因、氮吸收相关基因、糖酵解途径上的关键基因以及一些机动蛋白基因。这些发现说明东海原甲藻应对磷限制条件有多种策略,细胞调整一些关键通路上的基因表达使细胞能够适应周围磷限制的环境。