论文部分内容阅读
研究背景大多数抗HIV药物是作用于细胞内抑制HIV复制,而CCR5拮抗剂是通过阻断gp120与CCR5结合,阻止HIV进入宿主细胞,成为抗HIV药物研发的新领域。CCR5拮抗剂对X4嗜性病毒感染的患者不起作用,该药用于临床之前需了解患者的辅助受体利用情况。确定辅助受体利用情况的方法分为基因型方法和表型方法。表型方法是利用重组病毒、假病毒或活病毒感染可表达CCR5或CXCR4的细胞系,来检测辅助受体利用情况,是公认的金标准,但存在操作要求高、成本昂贵、耗时长的缺点。基因型方法是主要利用V3区氨基酸或核苷酸序列进行预测辅助受体利用情况,目前常用的在线预测工具为WebPSSM和Geno2pheno。基因型方法具有成本低、耗时短、技术简单易标准化的优点,但大多数基因型方法是基于B亚型和C亚型的V3区序列构建的,对于CRF0I AE和CRF07 BC重组亚型预测是否可行有待于进一步研究。CRF01 AE、CRF07 BC、CRF08 BC和B亚型己成为我国HIV-1主要的流行亚型。近年来,在MSM人群中发现了众多CRF01 AE/CRF07 BC、CRF01 AE/B、CRF01 AE/CRF07 BC/B独特重组亚型,其中流行传播发展为流行重组亚型的有 CRF55 01B、CRF59 01B、CRF67 01B、CRF79 0107 和CRF80 0107等。及时发现新的重组病毒并分析其亲本毒株的来源,有助于深入了解HIV-1的传播规律,为我国HIV-1的防治提供科学依据。研究目的1.了解我国主要流行的CRF01 AE和CRF07 BC重组病毒辅助受体利用情况,探讨基因型预测工具对CRF01 AE和CRF07 BC重组病毒辅助受体利用的可行性。2.通过分析HIV-1近全长基因序列,探索新的独特重组亚型和流行重组亚型。研究方法从样本库中选取从北京、广西、四川的HIV-1感染者中分离的22株CRF01 AE和19株CRF07 BC重组病毒,提取病毒RNA,逆转录成cDNA,采用近末端稀释法扩增获得近全长基因序列,对近全长序列进行亚型和重组模式分析。利用活病毒分别感染表达不同辅助受体的GHOST细胞,以HIV-1SF33(X4/R5)双嗜性作为阳性对照,正常细胞作为阴性对照,培养48小时后收集细胞,用流式细胞仪分析GFP的表达来判断HIV-1辅助受体利用情况。利用基因型方法(11/25规则、WebPSSM和Geno2pheno)对病毒辅助受体利用情况进行预测,将预测结果与经GHOST细胞系检测的表型实验结果进行比较。研究结果第一部分1.经GHOST细胞系检测,22株CRF01 AE重组病毒中,4株利用CCR5/CXCR4辅助受体,18株利用CCR5辅助受体;19株CRF07 BC重组病毒均只利用CCR5辅助受体。2.一致性分析结果显示:对于CRF01 AE重组病毒,11/25规则预测与表型实验的一致率为86.4%;geno2pheno 中,G2p-clinical、NGS-sanger和G2p-colon模型预测与表型实验的一致率分别为95.5%,86.4%,68.2%;WebPSSM中,PSSM-sinsi B、PSSM-x4r5和PSSM-sinsi C模型预测与表型实验的一致率分别为86.4%,72.7%和45.5%。对于CRF07 BC重组病毒,11/25规则预测与表型实验的一致率为94.7%;geno2pheno中,G2p-clinical、NGS-sanger和G2p-colon模型预测与表型实验的一致率分别为94.7%,94.7%,100.0%;WebPSSM中,PSSM-sinsi B、PSSM-x4r5和PSSM-sinsi C模型预测与表型实验的一致率分别为 100.0%,94.7%和 100.0%。3.V3区氨基酸净电荷分析结果:对于CRF01 AE重组病毒,R5/X4嗜性病毒中V3区净电荷分布在5-7之间,R5嗜性病毒的净电荷分布在2-7之间,经秩和检验,P<0.01,差异有统计学意义,R5/X4嗜性病毒V3区净电荷高于R5嗜性病毒。对于CRF07 BC重组病毒,R5嗜性病毒的V3区净电荷分布在2-5之间。4.V3区顶端四肽结果:CRF01 AE重组病毒中,共有GPGQ(68.1%)、GPGR(22.7%)、GPGH(4.5%)、GLGR(4.5%)四种顶端四肽。CRF07 BC重组病毒中,仅有GPGQ(100%)一种顶端四肽。第二部分1.鉴定一株CCR5嗜性的新的CRF01 AE/CRF07 BC独特重组病毒GX2016EU10,该病毒来自广西一名24岁的男同性恋患者,长度为8938bp(相对于HXB2位置为631-9603),由三个CRF01 AE片段和三个CRF07 BC片段重组而成,5个重组断点位置相对HXB2分别为1245、3864、5849、7895、8995。2.GX2016EU10的CRF01 AE片段V与主要流行于我国北方的男男同性性行为人群中的CRF01_AE g4a簇聚集在一起,Bootstrap值为92%;CRF07 BC片段II、IV、VI与来自于贵州男男同性性行为人群的GZ070087聚集成簇,Bootstrap值分别为96%、97%、71%。结论1.CRF01 AE重组病毒的HIV-1感染者,使用辅助受体拮抗剂前建议选择Geno2pheno预测工具进行辅助受体利用情况预测。在仅有V3区核苷酸或氨基酸序列的情况下,可选择Geno2pheno中的NGS-sanger 模型;在结合临床指标(CD4计数,病毒载量等)的情况下,建议选择Geno2pheno中的G2p-clinical模型进行预测。2.CRF07 BC重组病毒的HIV-1感染者,使用辅助受体拮抗剂前建议选择WebPSSM对辅助受体利用情况进行预测。3.GX2016EU10的出现增加了广西HIV-1流行的复杂性,需要对HIV-1高危人群的病毒多样性进行动态监测,加强分子流行病学调查,及时发现URF和CRF在不同人群中的分布,有助于深入了解HIV-1的传播规律,为我国HIV-1的防治提供科学依据。