基于定向自交系研究新型四倍体水稻育性的细胞遗传及相关基因

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同源四倍体水稻是由二倍体水稻原种通过染色体加倍形成的水稻新种质。该种质具有明显的生物学优势,但育性普遍偏低,产量优势无法发挥,难以直接应用于生产上。本室经过多年努力,利用不同类型同源四倍体水稻杂交培育出四倍体水稻新种质,并称之为新型四倍体水稻(neo-tetraploid rice)。该材料与同源四倍体水稻相比,育性显著提高,结实率可达80%以上,而且与低育性同源四倍体水稻杂交组配的杂种F1,产量优势明显,显示出广阔的利用前景。为了开展新型四倍体水稻高育性的遗传研究,本室利用新型四倍体水稻与低育性同源四倍体水稻杂交并对其后代进行定向选择,创建了高育性和低育性2个定向自交系群体。本文利用该自交群体的单株杂交,在后代通过定向选择,选择高和低育性的单株开展以下研究:一是生殖特性及育性相关的细胞学研究;二是通过高通量测序技术,对定向自交系全基因组变异分析;三是利用全基因组重测序,对高低定向自交系群体构建的混合池(BSA)进行分析;四是通过高通量测序技术,对高低定向自交系及其子代进行转录组测序分析,初步筛选育性相关基因。主要研究结果如下:(1)定向自交系群体及杂交后代生殖特性及细胞遗传。高育性定向自交系(XJG)早晚季平均结实率为75.14%,低育性定向自交系(XJD)平均结实率为9.51%,XJG显著高于XJD,高育性子代FG早晚季平均结实率为85.85%,低育性子代FD平均结实率为15.23%,子代结实率同样差异极显著。XJG早晚季平均花粉育性为87.40%,XJD为51.77%,FG为83.38%,FD为54.40%,两两对比它们的花粉育性,发现高育性材料明显高于低育性材料。高育性和低育性定向自交系及其子代减数分裂过程一致,都经历了9个时期。虽然不同材料在不同时期存在不同程度的异常现象,但低育性定向自交系和低育性子代减数分裂各时期的染色体行为的异常频率明显高于高育性材料。其中后期Ⅱ和末期Ⅱ2个时期最为明显,这两个时期XJD的异常频率分别为53.47%和47.12%,FD分别为53.76%和45.13%;而XJG则分别为31.63%和8.86%,FG分别为25.60%和7.36%。XJG终变期染色体构型为:(0.44±0.10)Ⅰ+(7.56±0.35)Ⅱ+(0.13±0.04)Ⅲ+(8.01±0.41)Ⅳ,中期Ⅰ染色体构型为:(0.37±0.09)Ⅰ+(8.98±0.60)Ⅱ+(0.26±0.08)Ⅲ+(7.22±0.36)Ⅳ;XJD终变期染色体构型为:(0.36±0.07)Ⅰ+(9.58±0.35)Ⅱ+(0.20±0.04)Ⅲ+(6.95±0.36)Ⅳ,中期Ⅰ染色体构型为:(0.68±0.14)Ⅰ+(9.98±0.58)Ⅱ+(0.32±0.08)Ⅲ+(6.60±0.32)Ⅳ;FG终变期染色体构型为:(0.50±0.09)Ⅰ+(9.07±0.43)Ⅱ+(0.24±0.06)Ⅲ+(7.18±0.41)Ⅳ,中期Ⅰ染色体构型为:(0.35±0.10)Ⅰ+(8.29±0.34)Ⅱ+(0.17±0.05)Ⅲ+(7.64±0.46)Ⅳ;FD终变期染色体构型为:(0.35±0.08)Ⅰ+(9.15±0.40)Ⅱ+(0.17±0.04)Ⅲ+(7.19±0.40)Ⅳ,中期Ⅰ染色体构型为:(0.63±0.12)Ⅰ+(9.83±0.48)Ⅱ+(0.38±0.08)Ⅲ+(6.64±0.34)Ⅳ。通过WE-CLSM技术调查统计高育性和低育性定向自交系及杂交后代的的胚囊育性。四份材料XJG、XJD、FG和FD胚囊育性分别为:91.52%、85.71%、91.72%和86.92%,差异不明显,且都在85%以上,说明这些材料成熟胚囊育性基本正常,不是引起低育性定向自交系结实率低的主要原因。(2)定向自交系群体全基因组变异分析。利用高通量测序技术对高和低两个定向自交系群体的亲本XJG和XJD进行全基因组重测序,XJG检测到SNP和InDel变异数分别为657289个和134465个;XJD分别检测到687503个和150139个。其中XJG特有的SNP为232128个,非同义突变为21627个,涉及到的基因为5939个;XJD特有的SNP为262352个,非同义突变为23560个,涉及到的基因为6154个。两个材料的特异InDel分别为45823个和54017个,其中移码突变分别为1342个和1514个,分别涉及到1102个和1168个基因,通过与减数分裂相关基因进行筛选,得到900个变异基因,基因富集分析表明,这些基因在DNA结构、减数分裂过程等发挥重要调控作用。(3)定向自交系群体及构建的混合池测序筛选差异基因。利用基于重测序技术衍生的BSA-seq技术对50X50混合池进行分析,得到位于1号染色体30790000-30910000区间共20个基因,位于2号染色体29640000-30080000区间共97个基因,位于7号染色体22730000-23390000区间共131个基因,位于8号染色体20160000-20880000、20910000-20930000、20950000-21130000区间共142个基因,总共390个基因,390个基因包含了81个在亲本或者子代之间发生了移码突变或者非同义突变,这81个基因可能与育性相关。(4)定向自交系群体及构建的混合池的转录组测序及分析。基于高通量测序技术对四个材料(XJG、XJD、FG、FD)减数分裂时期花药和子房进行转录组测序分析,亲本(XJG VS XJD)之间对比,共有1118个基因显著差异表达,412个基因上调,706个基因下调;子代(FG VS FD)之间对比,共有659个显著差异表基因,其中353个基因上调,396个基因下调,基因富集结果显示这些显著表达差异基因在DNA结合、转录因子活性等功能发挥重要调控作用。结合全基因组重测序结果、DNA-BSA结果、花药和子房转录组结果,筛选到三个基因LOCOs07g22680、LOCOs07g38630和LOCOs08g33190,其中LOCOs07g22680与减数分裂染色质重组、端粒形成与重组有关,基因LOCOs07g38630功能有待进一步验证,LOCOs08g33190与组蛋白H1和H5的连接有关,组蛋白H1和H5和DNA结合密切相关,这三个基因与水稻育性可能相关。
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