近些年来由于测序技术的提升，通过全基因组以及候选基因的分析，初步揭示了高原动物对低氧的适应机制，并且发现了一系列在高原适应中发挥作用的相关基因。目前已经了解HIF-2α是低氧信号通路中的关键调节因子，它的变异与藏族人群低氧适应具有密切的相关性。高原鼢鼠和以色列盲鼹鼠均为生活在低氧环境的地下穴居小型啮齿类动物。长期生活在低氧的环境中，高原鼢鼠和以色列盲鼹鼠均形成了一系列适应机制以应对长期低氧的环境。　　我们通过基因序列比对发现，高原鼢鼠中HIF-2α第480位丝氨酸替换了脊椎动物中保守的苏氨酸;在以色列盲鼹鼠HIF-2α启动子区域，相对于白垩土壤(chalk)盲鼹鼠，玄武岩土壤(basalt)盲鼹鼠存在-325T＞C，-496G＞A，-1810A＞T和-2023G＞A4个SNP变异位点。由于HIF-2α的变异与藏族人群对于高原低氧环境的适应具有密切的关系，我们提出假设:高原鼢鼠HIF-2α第480位氨基酸的变异和以色列盲鼹鼠在HIF-2α启动子区域存在的SNP位点与其环境适应相关。　　为了验证假设，本实验主要运用qRT-PCR、荧光素酶报告基因、Western Blot和EMSA等实验技术研究HIF-2α的位点变异对于高原鼢鼠和以色列盲鼹鼠低氧适应的影响。具体内容如下:　　1、高原鼢鼠HIF-2α磷酸化修饰差异分析　　通过PCR技术克隆出高原鼢鼠HIF-2α的420～540位氨基酸所对应的基因序列，将该基因序列构建到原核表达载体pET32上。再经定点突变将HIF-2α第480位丝氨酸突变为苏氨酸和丙氨酸，一起进行原核诱导表达，镍柱纯化后获得的可溶性融合蛋白TRX-S480、TRX-S480A、TRX-S480T。获得的融合蛋白进行体外磷酸化反应，Western Blot分析HIF-2α点突变对其磷酸化影响，结果发现当高原鼢鼠的丝氨酸突变为苏氨酸后其磷酸化修饰程度明显提高。　　2、S480T对高原鼢鼠HIF-2α转录活性和蛋白稳定性影响　　通过构建高原鼢鼠HIF-2α完整编码区序列的真核表达载体和HRE报告基因载体，再经定点突变得突变的真核表达载体。双荧光素酶报告基因实验分析发现，HIF-2α(480T)转录活性显著低于HIF-2α(480S)或HIF-2α(480A)。Western Blot分析当S突变为T后其表达明显降低。结合体内磷酸化修饰分析的结果，说明高原鼢鼠HIF-2α第480位氨基酸的变异能够抑制其磷酸化提高蛋白稳定性进而提高其转录活性。　　3、不同土壤环境以色列盲鼹鼠HIF-2α差异表达　　先用qRT-PCR实验分析不同土壤中HIF-1α、HIF-2α及其靶基因的差异表达，结果发现，HIF-1α及其靶基因在不同土壤的盲鼹鼠中并无差异，而HIF-2α的mRNA水平在白垩岩土壤盲鼹鼠中明显高于玄武岩土壤盲鼹鼠，但是HIF-2α的靶基因却无差异。　　通过克隆以色列盲鼹鼠HIF-2α启动子，构建报告基因载体。再由定点突变以及双荧光素酶报告基因实验分析SNP位点对其转录活性的影响。结果发现:-325T＞C，-496G＞A并不影响其转录活性;但是在-1810A＞T和-2023G＞A这两个位点我们发现当-1810为T，-2023为A时其转录活性最低，而这两个碱基在玄武岩土壤盲鼹鼠中的分布频率显著高于白垩土壤盲鼹鼠。双荧光素酶报告基因实验分析结果说明，HIF-2α上游调控区的-1810A＞T和-2023G＞A SNP显著抑制玄武岩土壤盲鼹鼠HIF-2α的转录水平，由于玄武岩土壤中氧浓度较低会导致HIF-2不易降解，推测抑制HIF-2α转录水平可以避免长期低氧环境下HIF-2靶基因的过度表达，这也与qPCR实验结果吻合。　　4、EMSA分析SNP对特定转录因子结合的影响　　软件预测显示-1810A＞T和-2023G＞A SNP可能分别对B-Myb和HNF4G这两个转录因子的识别与结合有影响。分别构建B-Myb和HNF4G真核表达载体，表达后提取核蛋白并进行EMSA分析，HIF-2α上游调控区的-2023G突变为A后，B-Myb与HIF-2α的结合消失，-1810A突变为T后增加了HNF4G的结合。由于B-Myb作为转录激活因子能够激活转录，而HNF4G可以与HNF4α结合降低其转录活性，推测转录因子结合位点的变化会抑制玄武岩土壤盲鼹鼠HIF-2α的转录水平，与报告基因结果一致。