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研究背景慢性疼痛作为一种应激源,是情绪障碍的首要决定因素。常见的情绪障碍主要包括焦虑和抑郁等。神经病理性疼痛作为慢性疼痛中的一种类型,高达30%的患者并发重度抑郁症。目前对神经病理性疼痛致焦虑抑郁的分子机制尚不清楚。脂肪与肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）,作为一种去甲基化酶,参与调节转录后mRNA m6A甲基化修饰。研究表明,FTO在初级感觉神经元中参与了神经病理性疼痛的产生和维持。FTO敲除的小鼠表现出焦虑和抑郁样行为。但FTO在疼痛致焦虑抑郁中的作用和具体机制尚不明确。本研究拟评价FTO在小鼠神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为中的作用及其分子机制,以期为慢性疼痛致焦虑抑郁的机制研究提供新的思路。实验目的1.探究FTO在神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为中的作用。2.探讨FTO介导神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为的分子机制。实验方法1.坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）小鼠的痛觉过敏和焦虑抑郁样行为变化雄性C57BL/6J小鼠20只,随机分为2组（n=10）:实验组（CCI组）和对照组（Sham组）,分别于术前1 d、术后3d、7 d、14 d、21 d和28 d测试小鼠术侧后足机械性撤足阈值（PWT）和热缩足潜伏期（PWL）;28 d后,分别通过旷场实验（OFT）、十字高架实验（EPM）观察小鼠焦虑样行为,通过强迫游泳实验（FST）和悬尾实验（TST）观察小鼠抑郁样行为。2.神经病理性疼痛小鼠ACC中FTO的表达变化及其细胞分布类型术后7 d、14 d、21 d和28 d,利用qRT-PCR技术检测小鼠ACC中FTO mRNA水平的表达变化,利用Western blot技术检测小鼠ACC中FTO蛋白水平的表达变化。利用免疫荧光技术检测ACC中FTO的表达变化及细胞表达类型。3.过表达ACC中FTO对神经病理性疼痛小鼠焦虑抑郁样行为的影响雄性C57BL/6J小鼠40只,随机分为2组（n=20）:实验组（CCI组）和对照组（Sham组）,分别进行手术,术后28 d,再次运用随机数字表将每组小鼠随机分成 2 组（n=10）,共 4 组:CCI+AAV-EGFP组、CCI+AAV-FTO组、Sham+AAV-EGFP组和Sham+AAV-FTO组,各组小鼠通过脑立体定位技术向手术对侧ACC显微注射AAV-FTO或AAV-EGFP。注射AAV后21 d,采用qRT-PCR技术检测小鼠ACC中FTO mRNA的表达变化。采用Western blot技术检测小鼠ACC中FTO蛋白水平的表达变化。运用免疫荧光技术观察AAV的转染情况和转染细胞类型。依次分别通过OFT、EPM观察小鼠焦虑样行为表现,通过FST和TST观察小鼠抑郁样行为,验证ACC中FTO过表达是否能逆转神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为。4.敲低ACC中FTO表达对Na?ve小鼠行为学的影响雄性 C57BL/6J 小鼠 20 只,随机分为 2 组（n=10）:Na?ve+AAV-FTO shRNA组、Na?ve+AAV-scrRNA组。各组小鼠通过脑立体定位向手术对侧ACC显微注射AAV-FTO shRNA或 AAV-scrRNA。注射AAV21 d 后,运用qRT-PCR技术检测神经病理性疼痛小鼠ACC中FTO mRNA水平的表达变化。运用Western blot技术检测神经病理性疼痛小鼠ACC中FTO蛋白水平的表达变化。分别依次通过OFT、EPM观察小鼠焦虑样行为,通过FST和TST观察小鼠抑郁样行为。5.FTO介导小鼠神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为的分子机制采用qRT-PCR技术检测神经病理性疼痛小鼠ACC中MMP-9 mRNA的表达变化。采用Western blot技术检测神经病理性疼痛小鼠ACC中MMP-9、proBDNF和mBDNF蛋白水平的表达变化。采用原位杂交技术结合免疫荧光技术,检测FTO蛋白与MMP-9 mRNA的细胞共定位情况。运用免疫荧光技术检测FTO蛋白与MMP-9蛋白的细胞共定位情况。CCI术后28d,运用RIP-PCR技术检测MMP-9 mRNA上FTO的富集情况（n=4）以及m6A在MMP-9mRNA上的富集情况（n=4）。运用qRT-PCR技术检测小鼠ACC过表达FTO后MMP-9 mRNA的表达变化。采用Western blot技术检测小鼠ACC中过表达FTO后MMP-9、proBDNF和mBDNF蛋白水平的表达变化。运用qRT-PCR技术检测小鼠ACC中敲低FTO表达后MMP-9 mRNA的表达变化。运用Western blot技术检测小鼠ACC中敲低FTO表达后MMP-9、proBDNF和mBDNF蛋白水平的表达变化。实验结果1.坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）诱导小鼠产生慢性痛觉过敏和焦虑抑郁样行为疼痛行为学结果表明,与Sham组小鼠相比,CCI组小鼠PWT和PWL值于术后3d显著下降（P＜0.05）,并可以维持到术后28 d,提示坐骨神经慢性压迫损伤可以诱发小鼠产生痛觉过敏,表明神经病理性疼痛模型制备成功。OFT结果显示,两组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与Sham组小鼠比较,CCI组小鼠在旷场中间区域停留时间的百分比明显降低（P＜0.05）,且进入中央区域的次数明显减少（P＜0.05）。EPM实验结果显示,两组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与Sham组小鼠比较,CCI组小鼠在开放臂停留的时间百分比明显降低（P＜0.05）,且进入中央区域的次数明显减少（P＜0.05）,说明神经病理性疼痛诱发了小鼠焦虑样行为。FST的结果显示,与Sham组小鼠比较,CCI组小鼠在测试期间静止不动的时间明显延长（P＜0.05）;TST实验中,与Sham组小鼠比较,CCI组小鼠在测试期间静止不动的时间明显延长（P＜0.05）,提示神经病理性疼痛诱发了小鼠抑郁样行为。以上结果表明,神经病理性疼痛可以诱发小鼠焦虑抑郁样行为。2.神经病理性疼痛小鼠ACC中FTO表达下调qRT-PCR和Western blot结果显示,与Sham组小鼠相比,CCI组小鼠对侧ACC中FTO mRNA和蛋白表达于术后7d下调,并可持续至术后28d（P＜0.05）。免疫荧光单染结果表明,与手术同侧相比,CCI组小鼠手术对侧ACC中FTO阳性细胞百分比显著降低（P＜0.05）。免疫荧光双染结果表明,FTO主要表达在ACC的神经元中（NeuN,神经元核抗原）,在星形胶质细胞（GFAP,星形胶质细胞标志物）或小胶质细胞（OX42,小胶质细胞标志物）中稀疏表达。3.过表达ACC中FTO可改善神经病理性疼痛小鼠的焦虑抑郁样行为qRT-PCR 的结果显示,与 Sham+AAV-EGFP 组和 CCI+AAV-EGFP 组相比,Sham+AAV-FTO组和CCI+AAV-FTO组小鼠ACC中FTO mRNA水平明显上调（P＜0.05）。Western blot的结果表明,与 Sham+AAV-EGFP组和CCI+AAV-EGFP组相比,Sham+AAV-FTO组和CCI+AAV-FTO组小鼠FTO蛋白水平明显上调（P＜0.05）。免疫荧光结果显示,AAV主要转染到ACC神经元中,在星形胶质细胞和小胶质细胞中无明显转染。OFT结果显示,4组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与CCI+AAV-EGFP组相比,CCI+AAV-FTO组小鼠在旷场中央区域的停留时间百分比明显增加（P＜0.05）,进入中央区域次数明显增加（P＜0.05）;EPM实验结果显示,4组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与CCI+AAV-EGFP组相比,CCI+AAV-FTO组小鼠在开放臂的探索时间百分比明显增加（P＜0.05）,进入开放臂次数有增加趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;以上结果表明,逆转CCI小鼠ACC中FTO的下调,可以改善神经病理性疼痛诱导的焦虑样行为。FST结果显示,与CCI+AAV-EGFP组相比,CCI+AAV-FTO组小鼠测试期间保持不动时间明显缩短（P＜0.05）。TST结果显示,与CCI+AAV-EGFP组相比,CCI+AAV-FTO组小鼠测试期间保持不动时间有缩短趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。以上结果表明,逆转CCI小鼠ACC中FTO的下调,可以改善神经病理性疼痛诱导的抑郁样行为。4.敲低ACC中的FTO表达可诱导Na?ve小鼠的焦虑和抑郁样行为qRT-PCR和Western blot结果显示,与Na?ve+AAV-scrRNA组相比,Na?ve+AAV-FTO shRNA组小鼠ACC中FTO mRNA和蛋白表达发生明显下调（P＜0.05）。OFT结果表明,两组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与Na?ve+AAV-scrRNA组相比,Na?ve+AAV-FTO组小鼠在旷场中间区域停留时间的百分比明显降低（P＜0.05）,且进入中央区域的次数明显减少（P＜0.05）。在EPM实验中,两组小鼠测试期间的运动能力无显著差异（P＞0.05）;与Na?ve+AAV-scrRNA组相比,Na?ve+AAV-FTO组小鼠在开放臂停留的时间百分比明显降低（P＜0.05）,且进入中央区域的次数明显减少（P＜0.05）,提示ACC中FTO敲低后诱发了小鼠焦虑样情绪。FST和TST的结果显示,与Na?ve+AAV-scrRNA组相比,Na?ve+AAV-FTO组小鼠静止不动的时间明显延长（P＜0.05）,提示敲低ACC中FTO可以诱发小鼠抑郁样行为。5.FTO通过调节MMP-9/BDNF信号通路参与神经病理性疼痛致焦虑抑郁样行为qRT-PCR结果表明,CCI术后28 d,两组小鼠ACC中MMP-9 mRNA表达水平无明显变化,Western blot结果表明,与Sham组相比,CCI组小鼠ACC中MMP-9蛋白水平明显下降（P＜0.05）proBDNF蛋白表达增加（P＜0.05）,而mBDNF蛋白水平下降（P＜0.05）。原位杂交与免疫荧光结果显示,MMP-9mRNA与FTO蛋白在ACC神经元中高度共表达;免疫荧光双染显示,FTO蛋白与MMP-9蛋白在ACC中高度共表达。FTORIP-PCR结果显示,与Sham组相比,CCI组小鼠ACC中MMP-9 mRNA上FTO富集程度明显降低（P＜0.05）;m6ARIP-PCR结果显示,MMP-9 mRNA上m6A富集程度增加（P＜0.05）。以上结果提示,神经病理性疼痛小鼠ACC中,MMP-9 mRNA上FTO富集程度降低,MMP-9 mRNA上m6A修饰增加。与CCI+AAV-EGFP组相比,CCI+AAV-FTO组小鼠ACC中MMP-9mRNA水平无明显变化（P＞0.05）,而MMP-9蛋白表达上调（P＜0.05）,mBDNF蛋白表达上调（P＜0.05）,proBDNF蛋白表达下调（P＜0.05）。与Na?ve+AAV-scrRNA组相比,Na?ve+AAV-FTO shRNA组小鼠ACC中MMP-9 mRNA水平无明显变化（P＞0.05）,MMP-9蛋白表达下调（P＜0.05）,mBDNF蛋白表达下调（P＜0.05）,而proBDNF蛋白表达上调（P＜0.05）。以上结果表明,FTO通过调控MMP-9 mRNA上m6A修饰来调节MMP-9蛋白表达,影响proBDNF/mBDNF的动态平衡,调节神经病理性疼痛小鼠的焦虑抑郁样行为。实验结论坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）介导的神经病理性疼痛小鼠ACC中FTO下调,MMP-9 mRNA m6A甲基化修饰水平上调,MMP-9蛋白表达下调,通过影响proBDNF/mBDNF的动态平衡,参与神经病理性疼痛所致的焦虑抑郁样行为。