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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是引起心血管疾病的主要原因。研究表明,AS是脂质代谢失衡和持续炎症反应的结果,是大量脂质和胆固醇聚集并产生纤维斑块的慢性炎症性疾病。因此,基于AS的发病机制,发现治疗AS的药物,对AS等相关心血管疾病的防治具有重要意义。补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)作为补气、活血、祛瘀代表方剂,对AS造成的心脑血管疾病疗效确切,但其具体机制还尚未完全阐明。调节性T细胞(Treg)在调节免疫系统平衡、维持机体内环境的稳定中发挥重要作用。已有研究结果表明Treg细胞主要通过控制免疫、炎症反应、减少脂质沉积从而抑制AS斑块。然目前,从免疫炎症角度阐明BYHWD治疗AS的作用机制尚未见报道。为了阐释BYHWD抗AS的药效物质基础,本论文以免疫炎症学说为理论指导,以Treg细胞为切入点,提出假说:BYHWD能调控TGF-β/Smad信号通路,促进Treg细胞外周分化,进而增加其数量,恢复CD4~+T细胞之间的免疫平衡,调节脂质代谢、抑制炎性反应、稳定AS斑块。一方面,为进一步明确BYHWD的药理作用提供理论和实验依据;另一方面,基于免疫、炎症角度探讨中药对斑块的保护作用及机制,为临床多靶点入手稳定斑块提供新思路。在完成上述实验研究的同时,建立了基于壳聚糖溶液涡旋辅助基质固相分散萃取技术并将该方法应用在中药女贞子的绿色质量评价中,为中药女贞子的临床应用与开发奠定基础。具体结果如下:1.参照经典文献描述方法,通过Apo E-/-小鼠经高脂饮食饲养12周,以成功复制AS模型。BYHWD治疗4周后,采用油红O和HE染色的方法观察BYHWD对于AS小鼠全主动脉及心脏主动脉窦内斑块形成的影响,初步验证BYHWD对于AS小鼠的治疗作用。通过主动脉窦油红O染色观察小鼠主动脉窦内脂质沉积情况,同时检测血清内血脂含量,从调节脂质代谢方面来阐明BYHWD抑制AS发展的可能机制。实验结果显示,BYHWD能明显减少AS小鼠全主动脉及主动脉窦内斑块面积,对AS小鼠具有治疗作用。同时,BYHWD可减少AS小鼠主动脉窦内脂质浸润情况,降低血清内TC,TG,LDL-C的含量,进而抑制斑块进展,达到抗AS的目的。Foxp3作为Treg细胞的特异性标志,在Treg细胞分化、发育及调节免疫功能中发挥重要作用。检测AS小鼠体内Treg细胞数目及Foxp3的表达情况,发现BYHWD能够显著增加Treg细胞数目,上调Foxp3的表达,且能增加血清中Treg细胞分化相关因子TGF-β和IL-10的含量。此外BYHWD能够调控TGF-β/Smad2通路,从而促进Treg细胞分化。同时,BYHWD给药4周后,AS小鼠血清内促炎因子IL-6,TNF-α,IFN-γ,MMP-9的含量显著下降。由此可以得出结论:BYHWD通过调控TGF-β/Smad2通路促进Treg细胞外周分化,调节炎症反应及免疫平衡,是其抗AS的潜在机制之一。为接下来体外进一步验证补阳还五汤对Treg细胞数目和功能的作用奠定基础。2.氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对于Treg细胞功能的影响可能是通过ox-LDL作用于Foxp3实现的。本实验通过体外免疫磁珠分选CD4~+T细胞,经ox-LDL刺激后,给予BYHWD含药血清干预,从体外检测BYHWD调控TGF-β/Smad通路、促进Treg细胞外周分化的作用。实验结果显示,BYHWD可以体外促进Treg细胞分化,改善CD4~+T细胞免疫失衡状态,调节炎症因子表达,增加细胞上清内抗炎因子TGF-β,降低促炎因子IL-6,IFN-γ的含量。此外,BYHWD从m RNA水平上调控Foxp3/TGF-β/Smad2信号通路。由此可以得出结论:在免疫失衡状态下,BYHWD可以通过调控TGF-β/Smad2通路,促进Treg细胞分化,改善CD4~+T细胞免疫失衡状态。3.建立了基于壳聚糖溶液的涡旋辅助基质固相分散萃取技术并将其应用在中药女贞子的绿色质量评价中:采用涡旋辅助基质固相分散(VFMSPD)技术结合配备紫外检测器的高效液相色谱法(HPLC-UV)方法,对中药女贞子中4中活性成分(松果菊苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13)同时进行定量分析。在VFMSPD方法中,以壳聚糖溶液为绿色洗脱剂,采用HPLC-UV对目标分析物进行分析。通过单因素优化实验对MSPD技术中重要的参数进行考察和优化,最终得到最佳提取条件为:Celite AZO为分散剂,样品与分散剂比为1:1,研磨2 min,用1 m L高粘度壳聚糖溶液(0.5 mg/m L)作洗脱剂,涡旋混合1.5 min。方法学考察结果显示,该方法线性关系良好(r~2>0.999),最终优化得到的目标化合物的绝对回收率为90.7%～98.8%,相对回收率为99.2%～102%(RSD≤3.4%)。因此,新建立的壳聚糖溶液涡旋辅助基质固相分散萃取(MSPD)结合高效液相色谱(HPLC)法可有效地用于女贞子中目标化合物的提取和分析,为中药女贞子的绿色质量评价奠定基础。