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酿酒酵母是存在于自然界中的一种单细胞真核生物,其细胞结构与植物、动物细胞结构相似,且便于研究,常作为真核生物研究的模式生物。传统酿酒酵母研究集中于其在食品,饮料,药品方面的应用。目前,关于酿酒酵母的研究更多的是分子水平的研究:一方面,通过单基因或多基因敲除研究酿酒酵母基因的功能,并根据其与高等动物基因的同源性,了解人类基因的功能。另一方面,通过改良酿酒酵母基因组,获得高效表达人类所需的产品的工程菌,比如,乙醇、谷胱甘肽、青蒿素等生产菌株。酿酒酵母S288C是第一个完成全基因组测序的真核生物。酿酒酵母S288C具有16条染色体,包含6275个基因,其中只有5885个基因编码蛋白,必需基因的比例不足20%。酿酒酵母基因组内存在较多的非必需基因和遗传丰余。从生物能量的角度来看,这些非必需基因和遗传丰余的存在会消耗酿酒酵母细胞大部分的能量。通过删除这些非必需序列,在满足酿酒酵母自身生存的情况下,使生物能量更多的流向外源基因和外源功能模块的表达,获得酿酒酵母最小的基因组成为当今研究的热点。
本实验首先通过日本研发的预测软件预测出酿酒酵母S288C来源的BY4741XVI染色体上非必需基因(缺失不会导致酿酒酵母的死亡),然后用自我设计的基因敲除方法称为LP法,敲除这些非必需基因,精简了酿酒酵母基因组。其次,针对基因敲除过程中影响敲除效率的因素进行了优化,来提高基因敲除效率。一方面,通过敲除酿酒酵母非同源重组途径中的关键连接酶编码基因nej1,破坏酿酒酵母非同源重组途径,减少非同源重组事件,提高同源重组率。结果表明,这种方法在提高同源重组效率的同时,降低了外源核酸转化效率,并未达到理想的效果;另一方面,利用本实验室保存的疏水蛋白HGFI毕赤酵母表达株发酵表达具有特殊理化性质的小分子疏水蛋白HGFI,然后将其应用于酿酒酵母醋酸锂转化方法中,并与传统单链鲑精DNA(ssDNA)作对比。结果表明,疏水蛋白HGFI对酿酒酵母的转化有促进作用,甚至比传统ssDNA更为理想。因此,本实验又进一步研究了疏水蛋白HGFI促进酿酒酵母转化的机理,研究结果表明,这种疏水蛋白HGFI促进酿酒酵母转化的原因是其对外源核酸具有包裹作用,可以保护外源核酸。本研究一方面获得了一株XVI染色体非必需基因的缺失菌株,精简了酿酒酵母基因组,为后续研究提供了材料;另一方面,创建了针对于端粒侧基因的敲除方法及一种新的酿酒酵母转化方法,为后续研究打下了坚实的理论和方法基础。