自从Schapiro等人在1943年首次提出早泄这一概念以来,早泄的具体定义就一直存在争论。早期的早泄的定义通常由各类专业学术组织或者个人整理,然而这些定义普遍存在缺陷,主要包括:非循证的、缺乏专业的操作标准、过分含糊、以及过分依赖于诊断者的主观判断。直到2013年ISSM召开专家会议,才完善了原发性早泄和继发性早泄的定义。早泄的病因复杂,阴茎感觉神经敏感化在早泄发生中的作用逐步受到关注。Xin等人通过对120例原发性早泄患者与对照进行阴茎震动阈值的测定,证实原发性早泄患者阴茎头及阴茎体对震动刺激的阈值明显降低。与Xin等人的研究相反,Salonia等发现早泄患者存在阴茎去敏感化,而非阴茎敏感化。我们认为,造成这种不一致的原因是大多数研究早于新的ISSM关于早泄的定义,因此,“正常”和“早泄”的定义在不同的研究之间存在差异,缺乏统一的标准。此外,相对较小的样本量也导致了研究结论之间可能存在的矛盾。因此,我们应用ISSM最新的早泄定义筛选病人,并使用阴茎生物震动感觉阈值检查仪重新评估阴茎神经敏感化和原发性早泄之间的关系。为深入研究原发性早泄的发病机制及病理过程,我们采用基于射精连续统一理论方式建立早泄大鼠模型,并为进一步研究早泄外周神经敏感化的机制奠定基础。Piezo通道是2010年由Coste等首先发现并证实具有完全独立的机械刺激敏感性,这一发现被认为在神经生物学领域具有里程碑式的意义。虽然Piezo2通道在正常触觉感受中的作用已被肯定,但该通道在阴茎机械感受中的生理作用,特别是在早泄外周感觉神经敏感化中的作用尚无研究。本研究中,我们的通过自然筛选方式建立早泄大鼠模型,逐步明确阴茎神经末梢及支配阴茎的背根神经节(DRG)神经元上是否有Piezo2表达。然后进一步探索阴茎DRG神经元上Piezo2通道表达及功能变化在阴茎机械刺激敏感化(外周敏感化)中的作用。第一部分:阴茎神经敏感化在早泄中的作用目的:评估阴茎神经敏感化和原发性早泄之间的关系。方法:1.连续纳入我院泌尿外科就诊的以“射精过快”为主诉的患者共420例,排除不符合纳入标准及可能存在受试者偏倚的,213例原发性早泄患者被纳入研究。2.要求患者在四周时间内至少有四次性交,根据患者报告,记录阴道内射精潜伏期(秒表法)。根据IELT将所有原发性早泄患者分为轻度早泄组:IELT≥30s且≤60s,共152人;重度早泄组:IELT<30s,共61人,剩余的124例患者由于不符合早泄的诊断标准而被作为对照组。3.阴茎皮肤感觉阈值通过阴茎生物震动感觉阈值检查仪综合评估并记录。结果:1.阴茎感觉阈值与IELT之间的相关性分析:(1)在对照组中,阴茎感觉阈值与IELT之间未发现具有统计学意义的相关性(阴茎头:rs=0.127,P=0.161;阴茎体:rs=0.156,P=0.084)。在早泄组中阴茎感觉阈值与IELT之间具有明显正相关性(阴茎头:rs=0.349,P=0.0001;阴茎体:rs=0.341,P=0.0001)。(2)在轻度早泄组中,阴茎感觉阈值与IELT之间具有明显正相关性(阴茎头:rs=0.315,P=0.0001;阴茎体:rs=0.27,P=0.001)。(3)在重度早泄组中,阴茎感觉阈值与IELT之间也具有明显正相关性(阴茎头:rs=0.389,P=0.002;阴茎体:rs=0.354,P=0.005)。3.阴茎感觉阈值作为判断早泄严重程度的敏感性和特异性的ROC曲线:(1)早泄的龟头阈值的截断值为 4.25V(AUC:0.852,95%CI:0.813-0.892),该值对于区分早泄的状态具有73.4%的灵敏度和83.6%的特异度。(2)早泄的阴茎体阈值4.15V作为预测早泄严重程度的截断值水平。该值的AUC为 0.893(95%CI:0.895-0.927),灵敏度为 77.4%,特异性为 86.996。结论:原发性早泄患者阴茎外周神经存在敏感化,阴茎感觉敏感化可能是导致原发性早泄患者IELT较短的主要因素。此外,阴茎感觉阈值是预测早泄严重程度的有效指标。第二部分原发性早泄大鼠模型的建立目的:基于射精连续统一理论,评价自然筛选建立原发性早泄大鼠模型的可行性。方法:1.选取雄性Wistar大鼠170只,雌性Wistar大鼠85只,首先对雌鼠进行手术去势,然后在实验前48h注射苯甲酸雌二醇20μg(溶解于0.1ml的芝麻油),在实验前4h皮下注射黄体酮500μg(溶解于0.1ml的芝麻油)来诱导雌鼠发情。2.筛选实验时间为19:00-21:00,将雄性大鼠和预先激素诱导处理完毕雌性大鼠1:1合笼,交配实验连续进行6次,每周1次,由于雄性大鼠交配逐步趋于稳定,故记录后3次大鼠的交配过程。3.记录骑跨潜伏期、射精潜伏期、插入潜伏期、射精次数和骑跨次数等指标。4.根据EF均值将雄鼠分为三组,其中EF均值≤1划分为“射精延迟”组,1<EF均值≤2.5划为“射精正常”组,EF均值>2.5划为“射精过快”组结果:最终成功记录了 134只雄性大鼠的后3次交配过程,其中“射精正常”组雄性大鼠104只,平均射精次数为2.07±0.74;“射精延迟”组雄性大鼠14只,平均射精次数0.63±0.42;“射精过快”组雄性大鼠16只,平均射精次数4.04±0.56。“射精过快”组雄性大鼠的EL值较“射精正常”及“射精延迟”组大鼠明显缩短,“射精过快”组雄性大鼠的MF值较“射精正常”及“射精延迟”组大鼠显著减少,差异均存在统计学意义(P<0.01)。结论:根据EF值可有效地筛选出“射精过快”的雄性大鼠,该动物模型的成功建立对深入研究原发性早泄具有重要意义。第三部分阴茎DRG神经元机械感受Piezo2通道参与早泄发生的实验研究目的:应用分子生物学、电生理学及行为学等方法,研究Piezo2通道在早泄大鼠阴茎DRG神经元的表达及功能变化。方法:1.背根神经节(DRG)的标记及分离:将Dil(1,1’-双十八烷基--3,3,3’-四甲基-吲哚-羰花青-高氯酸盐)染料注射到阴茎龟头逆行标记背根神经节神经元,10-14天后麻醉大鼠,手术分离双侧L6-S1 DRGs,显微镜下取出。2.免疫组化分别观察阴茎神经末梢及阴茎DRG上Piezo2表达情况。3.免疫组化及RT-PCR定量检测比较Piezo2通道在早泄大鼠和正常大鼠阴茎L6-S1 DRGs的差异表达。4.钙成像技术:首先在荧光显微镜找到DiI标记的DRG神经元,然后将玻璃微电极呈45度角接近细胞,并给与4um位移的机械刺激,刺激的同时记录神经元胞内钙离子信号的变化。5.膜片钳技术:以MP-285微操将刺激电极呈45度角接近细胞,并给予4um位移的机械刺激步进,记录电极记录膜内向电流变化。6.FM1-43对机械电流的阻断作用:在给予细胞第一次机械刺激后,应用Piezo2通道的特异性阻断剂FM1-43(10 uM)5分钟,然后再给予第二次机械刺激,并分别记录膜内向电流变化。7.Piezo2的反义寡核苷酸干扰:将预先筛选的正常大鼠分成对照组,错义寡核苷酸组,反义寡核苷酸组三组,先用DiI染料标记,然后进行手术鞘内置管,并应用微量注射器注射寡核苷酸。8.寡核苷酸干扰后的免疫组化和PCR检测:将寡核苷酸干扰大鼠按照前述的方案进行Piezo 2免疫组化及PCR检测及定量分析,证实寡核苷酸干扰的有效性。9.寡核苷酸干扰后的膜片钳研究:经寡核苷酸干扰的大鼠,按照前述的方案进行膜片钳检测,记录机械刺激诱发的电流变化。10.反义寡核苷酸干扰后的早泄大鼠行为学观察:对预先筛选的射精过快大鼠进行寡核苷酸干扰,观察反义寡核苷酸干扰后大鼠性行为学指标的变化。结果:1.免疫组化显示:Piezo2通道在大鼠龟头神经末梢及L6-S1 DRG均有丰富表达。2.免疫组化及RT-PCR定量分析显示:Piezo2通道在早泄大鼠DRG中的表达较正常大鼠明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。3.相同机械刺激下早泄大鼠胞内钙升高幅度(2.62±0.61)明显大于正常大鼠(1.84±0.53),且差异有统计学意义(P=0.004)。4.机械刺激可诱发一种快速激活且快速失活的内向电流,该电流可被Piezo2通道的特异性阻断剂FM1-43阻断(P<0.01)。早泄大鼠机械刺激诱发内向电流密度为15.12±5.03pA/pF明显高于正常大鼠机械刺激诱发内向电流密度9.78±3.52A/pF,差异存在统计学意义(P<0.01)。5.早泄大鼠DRG神经元电流的激活时间为915±150ms,电流失活至80%的时间为670±200ms;正常大鼠DRG神经元分别为680±110ms,和510±150ms,两组大鼠机械诱导的电流的激活和失活特性无明显差异(P>0.05)。6.免疫组化和PCR定量检测分析显示:Piezo2通道在反义寡核苷酸组大鼠阴茎DRG中表达较错义寡核苷酸组和对照组明显下调,差异有统计学意义(P<0.01)。7.膜片钳显示机械刺激诱发的内向电流密度在反义寡核苷酸组为3.77±1.40A/pF,在对照组和错义寡核苷酸组分别为:9.81±4.12pA/pF和9.08±4.94pA/pF,三组有显著性差异(P<0.01)。但三组大鼠机械诱导的电流的激活和失活特性无明显差异(P>0.05)。8.反义寡核苷酸干扰的早泄大鼠和错义寡核苷酸组早泄组大鼠相比,反义组射精潜伏期值(EL)明显延长,骑跨次数(MF)明显增加,射精次数明显减少,差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论:Piezo2通道在大鼠龟头神经末梢及L6-S1的DRG上丰富表达,早泄大鼠DRG上Piezo2通道表达上调,机械刺激诱导的电流密度增强,且此通道电流可被Piezo2特异性阻断剂FM1-43阻断,同时,经Piezo2反义寡核苷酸干扰的大鼠机械电流密度明显降低,反义寡核苷酸干扰后早泄大鼠性行为指标明显改善,证实Piezo2通道在大鼠阴茎外周神经敏感化中起重要作用。