目的:恶性肿瘤发病率增高,严重危害人类健康。目前针对肿瘤手术、放疗、化疗三大常规治疗方法却远远不能改变肿瘤治疗的现状。近年来随着分子生物学技术的发展、免疫学理论不断丰富,现代免疫学技术也在不断地推陈出新,人们从细胞和分子水平上对肿瘤与免疫系统的关系有了更深刻的认识,为肿瘤免疫疗法在临床上的应用奠定了坚实的基础。过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy ACI)已经成为继手术、放疗和化疗后的第四种治疗模式。过继性细胞免疫疗法是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。目前以抗体疗法、T细胞疗法和肿瘤疫苗为代表的肿瘤被动免疫和主动免疫治疗,己经取得显著的进展,作为肿瘤治疗的辅助手段在临床上显示出光明的应用前景。过继免疫治疗的关键在于筛选具有肿瘤特异性杀伤作用的效应细胞,对靶细胞即肿瘤细胞产生致命的杀伤,以实现过继免疫治疗高效低毒的特点。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte CTL)具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点成为过继免疫治疗中常用效应细胞而倍受关注。如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高过继免疫治疗效果的关键。树突状细胞(DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞,具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原,并激活初始免疫反应的独特功能。本实验利用C57BL/6小鼠DC细胞与T细胞共同培养,并且负载B16黑色素瘤特异性抗原,以便获得数量更多、杀伤活性更高,更具有特异性的抗肿瘤效应细胞DC-CTL。但是在体内试验中发现,抗肿瘤效应细胞在肿瘤微环境中通常被诱导进入“免疫无能”(immune anergy)状态,因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞,出现效应细胞与肿瘤细胞大量共存的尴尬局面。消除体内的免疫抑制细胞,充分发挥效应细胞的功能,对于提高肿瘤的治疗效果具有重要意义。CD4~+CD25~+Treg细胞CD4~+细胞的新成员,目前较为常用的是根据产生的途径不同将CD4~+CD25~+Treg细胞分为自然产生的调节性T细胞(natural regulatory T cells nTreg)和诱导产生的调节性T细胞(induced regulatory T cells iTreg)两类。大量研究发现在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌症患者的外周血、肿瘤浸润淋巴结中都可以检测出CD4~+CD25~+Treg细胞。CD4~+CD25~+Treg细胞可能通过识别肿瘤抗原后活化发挥其免疫抑制作用。CD4~+CD25~+Treg通过细胞间相互接触或分泌细胞因子等机制,抑制机体抗肿瘤免疫应答的产生,使机体处于对肿瘤低应答或无应答状态。这些研究说明CD4~+CD25~+Treg细胞对于肿瘤的免疫治疗是一个重要的障碍。因此寻找既能增强免疫效应细胞的抗肿瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+Treg细胞阻抑作用的方法,将是提高和改善肿瘤免疫治疗的一个崭新途径。本研究将B16黑色素瘤特异性抗原致敏的成熟DC与T细胞共同培养,诱导生成具有肿瘤特异性免疫效应细胞DC-CTL。而且应用免疫磁珠分选的方法(magnetic cell sorting,MACS)去除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,从体外杀伤试验、体内的抑瘤效果、细胞形态学变化、对细胞增殖和凋亡的影响等多方面观察DC-CTL细胞的杀伤效果。同时比较于T细胞分化形成CTL的不同时期删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分对DC-CTL特异性杀伤效果的影响。从而探究DC-CTL细胞、Treg细胞在抗肿瘤免疫中所起的作用以及相互关系,为肿瘤的免疫治疗提供理论基础及实验室资料。方法:本实验以C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤动物模型作为研究对象,制备黑色素瘤动物模型,并应用60Coγ对小鼠黑色素瘤动物模型进行照射,使小鼠机体达到非髓性淋巴细胞删除状态,则C57BL/6小鼠的黑色素瘤动物模型的免疫细胞丧失。便于效应细胞回输完成免疫重建。取小鼠脾脏制备DC和T细胞,B16黑色素瘤细胞采用冻融法制备肿瘤全抗原。将B16黑色素瘤抗原致敏DC细胞完成肿瘤全抗原的负载。将DC与T共同培养,诱导T细胞分化产生效应细胞CTL。并通过流氏细胞术检测DC细胞的免疫表型,确定DC细胞成熟活性。用MACS法分别于DC细胞与T细胞共同培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分,便得到培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞与培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞2组。另设未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组及对照组2组。然后再将NMLD状态的B16黑色素瘤C57BL/6小鼠80只,按随机数字表法分为4组并经鼠尾静脉进行效应细胞DC-CTL回输。第1组:培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第2组:培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第3组:未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组。第四组:对照组。采用MTT染色法检测4组的体外杀伤实验,观察效应细胞DC-CTL对B16黑色素瘤的杀伤效果。同时观察体内回输DC-CTL效应细胞后小鼠的生活习性、肿瘤的临床特征、DC-CTL细胞及靶细胞的超微结构与细胞增殖与凋亡特征等形态学表现。证实特异性抗原负载的DC-CTL细胞对肿瘤的杀伤效能。最后,运用流氏细胞术(FACS)及酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量变化,证实化疗药物的抗肿瘤机制及对机体免疫系统的影响。结果:DC细胞诱导负载B16黑色素瘤肿瘤抗原的DC-CTL细胞活化时可见细胞增大、胞质丰富、活力良好。与肿瘤细胞接触后则诱导肿瘤细胞出现凋亡及胀亡表现,高效杀伤肿瘤细胞。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组、未删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组MTT法体外杀伤试验:三组效应细胞对肿瘤细胞都有较强的杀伤作用。培养前删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组和培养后删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组对B16黑色素细胞的杀伤作用明显高于(P<0.05)未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL细胞组。且随效靶比升高杀伤作用增强。培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的DC-CTL组间比较对B16黑色素细胞的杀伤作用没有显著性差异(P >0.05)。B16黑色素瘤的体内抑瘤试验三组实验组DC-CTL细胞均可使瘤体缩小。抑瘤率明显高于对照组(P<0.05);2组删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组抑瘤率明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg细胞DC-CTL效应细胞组(P<0.05),培养前后删除CD4~+CD25~+Treg细胞的具有肿瘤特异性的DC-CTL细胞组间比较没有明显差异(P >0.05)。流氏细胞术检测肿瘤细胞增殖周期的变化;3组实验组与对照组比较G0/G1期细胞比率、AI显著升高,S期无明显变化,G2/M期细胞比率、PI显著下降(P<0.05);删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组G0/G1期细胞比率、AI明显高于未删除CD4~+CD25~+Treg组,G2/M期细胞比率、PI显著低于未删除CD4~+CD25~+Treg组,S期无明显变化(P<0.05)。删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分两组之间比较G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和AI、PI均没有明显差异(P >0.05)。化疗药物改变肿瘤患者体内Treg细胞、TNF-α及IL-12含量,三种指标不仅说明化疗药物对机体免疫机能有显著影响,而且还可以做为评估化疗效果的指标。结论:1、特异性抗原致敏的DC-CTL细胞对B16黑色素瘤细胞有较强的杀伤作用。特异性抗原致敏的DC-CTL细胞可以作用于肿瘤细胞的细胞周期,影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。充分说明DC-CTL细胞是一种具有强大肿瘤杀伤能力且具有肿瘤特异性的过继免疫治疗的效应细胞。2、删除CD4~+CD25~+Treg细胞成分后的特异性抗原致敏的DC-CTL细胞抗肿瘤免疫效应更具特异性与高效。说明CD4~+CD25~+Treg能够抑制具有肿瘤特异性的效应细胞DC-CTL。去除CD4~+CD25~+Treg细胞,重新募集效应性T细胞能够增强机体的抗肿瘤作用,必将成为一种可行的肿瘤免疫治疗方法。3、不同时间删除CD4~+CD25~+Treg细胞后,从抑瘤作用、对肿瘤细胞细胞周期的影响和对肿瘤细胞的杀伤作用上都有一定的差异,但没有统计学意义,说明CD4~+CD25~+Treg细胞各个亚群的来源和作用机制还需要进一步的研究。4、化疗药物改变机体内CD4~+CD25~+Treg、TNF-α及IL-12含量,对机体免疫系统有显著影响。同时也是评估化疗效果的指标。联合使用中药可以减轻其毒副作用。