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一、目的通过研究阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白功能、表达的影响和P-糖蛋白对阿立哌唑、喹硫平转运的影响，探讨阿立哌唑、喹硫平与P-糖蛋白相互作用的机理。二、方法1．阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白的作用研究方法（1）细胞培养及Caco-2单层细胞模型建立，为阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白功能和表达的作用研究提供P-糖蛋白载体细胞和阴性对照细胞，同时为研究P-糖蛋白对阿立哌唑和喹硫平的作用提供转运模型。Caco-2细胞和ECV304细胞均采用DMEM高糖培养基进行常规培养，细胞荧光免疫法进行P-糖蛋白表达验证；建立Caco-2细胞单层模型采用transwell板接种细胞，用细胞电位仪、萤光黄及普奈洛尔转运实验进行模型验证。（2）采用MTT法和活细胞计数法确定喹硫平和阿立哌唑的体外最大无毒浓度，为阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白功能和表达的作用研究及P-糖蛋白对阿立哌唑和喹硫平的作用研究提供与细胞作用的最大浓度，保证细胞活力。（3）阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白功能的影响以ECV304细胞作为P-糖蛋白表达的阴性对照细胞，维拉帕米作为P-糖蛋白功能抑制的阳性对照，使用荧光分光光度法和流式细胞术分析阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白底物—罗丹明123在Caco-2细胞中外排的影响。（4）从mRNA水平和蛋白水平研究阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白表达的影响环孢素A作为MDR1基因mRNA上调和P-糖蛋白表达上调的阳性对照，不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照，采用RT—PCR技术分析阿立哌唑、喹硫平对Caco-2细胞MDR1基因mRNA水平表达的影响。使用流式细胞术分析阿立哌唑、喹硫平对Caco-2细胞上P-糖蛋白表达的影响。2．P-糖蛋白对阿立哌唑、喹硫平的作用研究方法（1）测定阿立哌唑、喹硫平与P-糖蛋白的体外亲和力，为后续研究提供参考。采用磷钼蓝法测定0.01～100μmol／L不同浓度阿立哌唑或喹硫平与P-糖蛋白共孵育时，ATP酶的活性变化，用米氏方程计算亲和力参数Vmax、Km、Vmax／Km，得到阿立哌唑、喹硫平与P-糖蛋白的体外亲和力。（2） P-糖蛋白功能对阿立哌唑、喹硫平转运的影响首先建立uplc-MS／MS同时测定阿立哌唑、喹硫平的方法，采用色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18柱（100mm×2.1mm，粒径1.7μm），柱温40℃，流动相：乙腈—30 mmol／L醋酸胺=63∶37（V／V），流速：0.3 ml.min-1，进样量4μl，质谱检测采用Waters Micromass Quattro Premier XE二极质谱仪，选用ESI+，检测模式为多反应监测模式（MRM）。样品氮气吹干再用1-氯代丁烷—三乙胺（5∶0.5）进行提取。再研究阿立哌唑、喹硫平在transwell上的Caco-2细胞单层模型中的双向转运，考察时间、药物浓度及P-糖蛋白抑制剂—维拉帕米对阿立哌唑、喹硫平转运的影响；用uplc-MS／MS测定阿立哌唑、喹硫平A到B侧和B到A侧的转运量，计算其表观渗透系数。三结果1．阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白的作用研究结果（1）细胞培养及Caeo-2单层细胞模型建立Caco-2细胞强表达P-糖蛋白，ECV304细胞弱表达P-糖蛋白；Caco-2单层细胞模型紧密且完整，细胞旁及跨细胞转运通路通透性良好。Caco-2细胞培养成功，Caco-2单层细胞模型成功建立，适合新型非典型抗精神病药与P-糖蛋白相互作用研究用；ECV304细胞适合作阴性对照。（2）细胞毒性实验阿立哌唑、喹硫平为50μmol／L时，细胞均未贴壁而死亡。小于等于30μmol／L时，细胞生长良好。阿立哌唑、喹硫平的最大无毒浓度为30μmol／L，适用于喹硫平和阿立哌唑对P-糖蛋白功能和表达影响的研究。（3）阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白功能的影响当浓度为0.01μmol／L时，喹硫平和维拉帕米组细胞内荧光强度与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），而阿立哌唑组细胞内荧光强度显著高于阴性对照组（P＜0.05），当浓度≥0.1μmol／L时，随着浓度的增加，阿立哌唑、喹硫平和维拉帕米都使细胞内荧光增强，与阴性对照组间有显著性差异（P＜0.05）。低浓度（0.01μmol／L）时，喹硫平和维拉帕米对P-gp的功能无影响，而阿立哌唑对P-gp有抑制作用；高浓度（≥0.1μmol／L）时，喹硫平、阿立哌唑和维拉帕米对P-gp的功能均有抑制作用。（4）阿立哌唑、喹硫平对P-糖蛋白表达的影响在mRNA水平上：喹硫平组的目的条带总灰度值与内参总灰度值之比大于阴性组，小于阳性对照组（P＜0.05）；阿立哌唑组目的条带总灰度值与内参总灰度值之比小于阴性组（P＜0.05）。喹硫平对Caco-2细胞的MDR1基因mRNA表达水平有上调作用，但小于环孢素A。阿立哌唑对Caco-2细胞的MDR1基因mRNA表达水平有下调作用。在蛋白水平上：在0.01～1μmol／L范围内，阿立哌唑组荧光强度和阴性对照组间无显著性差异（P＞0.05）；在10和30μmol／L浓度时，阿立哌唑组荧光强度显著弱于阴性对照组（P＜0.05）；在0.01～30μmol／L范围内，喹硫平组荧光强度均显著强于阴性对照组（P＜0.05），但显著弱于阳性对照组（P＜0.05）。在较低浓度（0.01～1μmol／L）时，阿立哌唑对P-gp的表达无影响；浓度较高（大于10μmol／L）时，阿立哌唑对P-gp的表达有抑制作用。0.01～30μmol／L范围内；喹硫平对P-gp的表达有诱导作用，但弱于环孢素A。2．P-糖蛋白对阿立哌唑、喹硫平的作用研究结果（1）阿立哌唑、喹硫平与P-糖蛋白的体外亲和力相同作用时间下，药物浓度越高，ATP被水解后释放的无机磷量越多；相同药物浓度下，P-糖蛋白与药物作用时间越长，ATP被水解后释放的无机磷量越多；Vmax／Km的大小顺序为：维拉帕米（2.16）＞喹硫平（1.29）＞阿立哌唑（1.15）。（2） P-糖蛋白功能对阿立哌唑、喹硫平转运的影响建立的uplc-MS／MS方法中，阿立哌唑、喹硫平的色谱峰均很尖锐并且半峰宽均只有约2.5s。一次进样的运行时间小于3min。最低检测限为0.005μg／L。阿立哌唑、喹硫平的线性范围均为0.05～5μg／L，线性方程：喹硫平：C=0.113R-0.140（r=0.997）；阿立哌唑：C=1.213R-0.002（r=0.999）。方法准确、灵敏、简单，成功用于P-糖蛋白功能对阿立哌唑、喹硫平转运的影响研究中，得出：阿立哌唑和喹硫平的表观渗透系数Papp值均随时间延长而增大，到一定时间趋向饱和状态，并随阿立哌唑、喹硫平浓度的增加而逐渐减小。在加入抑制剂维拉帕米后，Papp，ab值显著增大（P＜0.05），而Papp，ba值显著降低（P＜0.05）。P-糖蛋白功能抑制影响了阿立哌唑、喹硫平转运。四结论喹硫平和阿立哌唑均为P-糖蛋白的底物，与P-糖蛋白有较高亲和力。P-糖蛋白是引起喹硫平和阿立哌唑在转运过程中出现胞内外排现象的重要因素之一。阿立哌唑对P-糖蛋白的功能和表达均有抑制作用，阿立哌唑使用一段时间后，P-糖蛋白对阿立哌唑的外排作用减弱，这就是阿立哌唑在临床应用中尚没有耐药现象产生的原因之一。同时提示：临床上阿立哌唑和P-糖蛋白的其他底物合用时，会有药物相互作用发生，阿立哌唑可能会增加P-糖蛋白的其他底物在细胞内药物浓度，从而增加疗效或使毒性作用更强。因此，临床上将阿立哌唑与P-糖蛋白底物合用时，要注意适当的剂量调整。喹硫平虽然对P-糖蛋白的功能有抑制作用，但对P-糖蛋白的表达有诱导作用，喹硫平对P-糖蛋白作用的综合结果是：使用喹硫平时，P-糖蛋白对喹硫平的外排作用增强，这就是喹硫平在临床应用中出现耐药现象的重要原因之一。同时提示：临床上喹硫平和P-糖蛋白的其他底物合用时，会有药物相互作用发生，喹硫平可能会减少P-糖蛋白的其他底物在细胞内的药物浓度，从而降低疗效或减少毒性作用。因此，临床长时间使用喹硫平时，要注意适当调整喹硫平或合用的P-糖蛋白底物的剂量。