目的动脉粥样硬化是发生于大中动脉的慢性炎症性病变，以大量脂质沉积到血管壁为主要特点，并伴随多种免疫细胞浸润及平滑肌细胞增生，其所诱发的心脑血管疾病是发达国家及发展中国家常见的死亡原因之一。目前研究认为固有免疫应答（巨噬细胞）和适应性免疫应答（CD4+T细胞）均参与动脉粥样硬化的发生和发展，近年来对于CD4+T细胞在该疾病中的作用受到了广泛的关注。CD4+T细胞分为多种亚群，主要包括Th1、Th2和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）以及近年来发现的Th17细胞。Th1细胞促进动脉粥样硬化的发生，Th2细胞在该疾病中的作用还不是非常明确，尚存在争议。调节性T细胞在动脉粥样硬化中主要发挥了保护性的作用，能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成。然而，Th17在动脉粥样硬化中的作用尚不明确。Th17细胞是以分泌IL-17A为主要特征的CD4+T细胞群体，CD4+初始T细胞受抗原刺激后，在转录因子RORγt和RORα的调控下，IL-6和TGF-β联合作用即可促使初始T细胞分化成为Th17细胞。目前的研究认为Th17细胞及IL-17A参与多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生，例如：自身反应性脑脊髓炎（EAE）、类风湿性关节炎（RA）和结肠炎等，动脉粥样硬化是发生在动脉血管壁的慢性炎症性疾病，前期有研究显示急性冠状动脉综合症患者外周血中Th17细胞的比例及IL-17A的水平较健康人明显升高，而且在人的动脉粥样硬化斑块局部检测到IL-17A的存在，这就提示Th17细胞及IL-17A很有可能参与该疾病的发生和发展。但是，Th17细胞及其效应分子IL-17A在动脉粥样硬化模型小鼠的发生和发展中变化如何？对动脉粥样硬化斑块的形成究竟发挥什么样的作用，尚存在争议。IL-17A能否作为动脉粥样硬化的治疗靶点之一？IL-17A在该疾病中的作用机制是什么？目前这些问题尚不清楚，都非常值得研究和探索。为了明确Th17细胞及IL-17A在动脉粥样硬化发生发展中的作用，阐明其发挥作用的机制，为IL-17A的临床应用提供理论依据和实验基础，本论文拟从以下两部分进行研究：一、通过体内外实验确定Th17细胞及其主要效应分子IL-17A在动脉粥样硬化发展中的促进作用：（一）标准动脉粥样硬化小鼠模型和快速颈动脉损伤小鼠模型的建立：通过高脂饮食喂养建立标准动脉粥样硬化小鼠模型；高脂喂养联合颈动脉缩窄手术模拟血管狭窄，建立快速颈动脉粥样硬化小鼠模型，便于进行下一步研究。（二） Th17细胞及IL-17A在动脉粥样硬化斑块局部及外周免疫器官的表达：通过多种方法检测动脉粥样硬化斑块局部存在IL-17A及转录因子RORγt的表达以及Th17细胞的存在；流式细胞术检测动脉粥样硬化发生过程中，Th17细胞的比例及IL-17A在脾脏中呈现明显上升的趋势，而且Th17细胞的比例与动脉粥样硬化的发病程度以及血脂水平（TCH）具有明显的正相关。（三） Th17细胞及IL-17A对动脉粥样硬化斑块形成的影响：采用IL-17A中和性抗体或小鼠重组IL-17A对小鼠进行体内干预，从正反两个方面证实IL-17A能够促进动脉粥样硬化斑块的形成，并且发现IL-17A能够减少斑块局部平滑肌细胞的含量，提示IL-17A还能够促进斑块向不稳定方向发展。二、从巨噬细胞内质网应激、细胞凋亡入手探讨IL-17A促进动脉粥样硬化发展的分子机制（一） IL-17A对巨噬细胞凋亡的影响及作用机制：IL-17A在体外能够促进巨噬细胞的凋亡，进一步研究发现IL-17A在体外能够诱导小鼠及人来源的巨噬细胞发生内质网应激，而且在体内IL-17A也能够诱导斑块局部巨噬细胞发生内质网应激。体内用化学伴侣PBA干预小鼠能够缓解IL-17A诱导的巨噬细胞内质网应激，斑块局部凋亡的巨噬细胞亦明显减少，说明IL-17A能够通过诱导巨噬细胞内质网应激从而促进巨噬细胞凋亡。（二） IL-17A加剧动脉粥样硬化的发生机制： IL-17A单独作用及IL-17A联合PBA体内干预，发现IL-17A能够通过促进斑块局部巨噬细胞发生内质网应激进而导致巨噬细胞凋亡发挥加速动脉粥样硬化斑块形成的作用。（三） IL-17A诱导巨噬细胞内质网应激的机制：IL-17A能够上调巨噬细胞内脂质伴侣aP2的表达，而且IL-17A能够激活巨噬细胞NF-κB和MAPK通路（ERK，p38和JNK），进一步研究发现IL-17A是通过激活NF-κB通路和p38、ERK通路上调aP2的表达。最后我们采用aP2抑制剂证实IL-17A是通过aP2的上调诱导巨噬细胞内质网应激的发生。方法一、通过体内外实验确定Th17和其主要效应分子IL-17A在动脉粥样硬化发展中的促进作用（一）标准动脉粥样硬化小鼠模型和快速颈动脉损伤小鼠模型的建立：1.标准模型的建立：ApoE-/-雄性8周龄小鼠给予高脂饮食到小鼠16周和24周，同品系的C57BL/6野生型小鼠同时给予高脂喂养作为对照组。2.快速颈动脉损伤模型的建立：ApoE-/-雄性8周龄小鼠给予高脂饮食两周，即小鼠10周时行左侧颈动脉缩窄手术模拟血管狭窄，小鼠继续给予高脂饮食分别至16周和24周，同品系的C57BL/6野生型小鼠作为对照组。（二）Th17细胞及IL-17A在动脉粥样硬化斑块局部及外周免疫器官中的表达1.取小鼠主动脉根部和左侧颈动脉制备连续冰冻切片，HE染色和油红O染色检测斑块的形成和脂质沉积情况；免疫组织化学染色检测斑块局部IL-17A和IFN-γ表达，并用免疫荧光双染的方法检测IL-17A的细胞来源。2.取小鼠主动脉弓部抽提RNA，RT-PCR方法检测IL-17A，RORγt和IFN-γ，T-bet在斑块局部的表达。3.取小鼠脾脏制备脾细胞悬液，采用流式细胞术检测Th1和Th17细胞的比例。4.分析Th1和Th17细胞比例与动脉粥样硬化斑块大小的相关性以及与小鼠血脂水平的相关性。（三）Th17细胞及IL-17A对动脉粥样硬化斑块形成的影响1.中和性IL-17A抗体干预（1）ApoE-/-雄性8周龄小鼠20只给予高脂饮食两周，小鼠10周行左侧颈动脉缩窄手术，术后一周小鼠随机分为两组，实验组小鼠腹腔注射小鼠中和性IL-17A抗体（50μg/只），对照组小鼠腹腔注射同型对照。（2）干预结束后一周微型超声观察斑块形成情况，取小鼠左侧颈动脉和主动脉根部制备连续冰冻切片，油红O染色检测斑块大小。（3）免疫组化检测斑块局部巨噬细胞和平滑肌细胞的表达。2.外源性小鼠IL-17A干预（1）ApoE-/-雄性8周龄小鼠10只随机分为两组给予高脂饮食，小鼠11周时，实验组小鼠腹腔注射外源性小鼠重组IL-17A（2μg/只/次），对照组小鼠腹腔注射生理盐水。（2）干预结束后一周，取小鼠主动脉根部制备连续冰冻切片，油红O染色检测斑块大小。（3）免疫组化检测斑块局部巨噬细胞和平滑肌细胞的表达。二、从巨噬细胞内质网应激、细胞凋亡入手探讨IL-17A促进动脉粥样硬化发展的分子机制（一）IL-17A对巨噬细胞凋亡的影响及作用机制以及促进动脉粥样硬化斑块形成的机制1.体外实验（1）取小鼠腹腔巨噬细胞，加入IL-17A刺激后，Hoechst染色从细胞形态学上观察细胞凋亡，流式细胞术（Annexin V/PI染色）检测细胞凋亡的数量。（2）小鼠巨噬细胞系RAW264.7及小鼠腹腔巨噬细胞，IL-17A刺激后收取细胞蛋白，Western Blotting检测内质网应激标志分子p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表达。（3）人单核细胞来源细胞系Thp-1和人外周血单个核细胞，体外诱导成巨噬细胞，IL-17A刺激后收取细胞蛋白，Western Blotting检测内质网应激标志分子p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表达。（4）小鼠腹腔巨噬细胞，加入IL-17A刺激后，Western Blotting检测CHOP，caspase12和caspase3剪切体的表达。2.体内试验（1）ApoE-/-雄性8周龄小鼠30只给予高脂饮食，小鼠11周时随机分为三组，实验组其中一组给予腹腔注射小鼠重组IL-17A（2μg/只/次，每周一次），另外一组腹腔注射IL-17A（2μg/只/次，每周一次）和化学伴侣PBA（100mg/kg，每周两次），对照组小鼠腹腔注射生理盐水。（2）干预结束后一周，取小鼠主动脉根部制备连续冰冻切片，免疫组织化学方法检测斑块局部Moma-2（巨噬细胞）、p-PERK和p-eIF2α的表达以及CHOP和caspase12的表达；Tunnel染色检测斑块局部巨噬细胞凋亡。取小鼠主动脉弓部抽提蛋白，Western Blotting检测内质网应激标志p-PERK，p-eIF2α和XBP1s的表达以及CHOP，caspase12和caspase3剪切体的表达。（3）油红O染色检测斑块大小。（二）IL-17A诱导巨噬细胞内质网应激的机制1.小鼠腹腔巨噬细胞，IL-17A刺激后RT-PCR和Western Blotting检测aP2的表达。2.小鼠腹腔巨噬细胞在IL-17A作用前加入aP2抑制剂（BMS309403）刺激3小时，收取细胞蛋白，Western Blotting检测p-eIF2α和XBP1s的表达。3.小鼠腹腔巨噬细胞，IL-17A刺激后Western Blotting检测p-IκB，p-ERK，p-p38和p-JNK的表达；IL-17A刺激前分别加入NF-κB（PDTC），ERK（PD98059），JNK（SP600125）和p38（SB203580）抑制剂作用1小时，然后用Western Blotting方法检测aP2的表达。结果一、通过体内外实验证实Th17及效应分子IL-17A能够促进动脉粥样硬化的发生（一）Th17细胞及IL-17A在动脉粥样硬化斑块局部及外周免疫器官中的表达1.动脉粥样硬化斑块局部IL-17A和IFN-γ的表达为了研究Th17细胞和IL-17A在动脉粥样硬化发生中的作用，我们利用ApoE-/-雄性小鼠建立了快速颈动脉粥样硬化模型和标准动脉粥样硬化小鼠模型，取小鼠左侧颈动脉和主动脉根部制备连续冰冻切片并进行HE染色和免疫组化染色。结果发现，ApoE-/-小鼠8周时，血管壁仅出现内膜略微增厚没有明显斑块的形成，此时在斑块局部几乎检测不到IL-17A和IFN-γ。高脂喂养到小鼠16周时，血管内膜有明显的增厚，平滑肌大量增生，形成较厚的纤维帽，大量有核细胞浸润到斑块局部，其斑块结构和组成属于早期动脉粥样硬化斑块，此时斑块局部能够检测到IL-17A和IFN-γ的表达，而对照组小鼠没有明显的斑块形成也检测不到IL-17A和IFN-γ的表达。小鼠继续高脂喂养到24周时，斑块大小较16周增加，纤维帽明显变薄，斑块表面仅有很薄的内皮细胞覆盖，平滑肌细胞减少，斑块内呈现多个空泡样的结构即坏死核，此时的斑块属于动脉粥样硬化晚期斑块，同龄的野生型C57BL/6小鼠此时也没有明显的斑块形成，免疫组化在斑块局部仅能检测到IL-17A，几乎检测不到IFN-γ的存在。此外，我们还采用RT-PCR检测了主动脉弓部IL-17A和IFN-γ及转录因子RORγt和T-bet的表达，与免疫组化结果一致，在早期斑块和晚期斑块局部均能够检测到IL-17A的表达，且较对照组小鼠明显升高；但是IFN-γ仅在早期斑块局部能够检测到而在晚期则几乎检测不到。RORγt和T-bet分别调控Th17和Th1细胞的分化，在ApoE-/-小鼠8周时表达即明显高于对照组小鼠，而且其表达持续升高能够维持到动脉粥样硬化斑块晚期。为了确定IL-17A的细胞来源，我们采用免疫荧光双染的方法证实斑块局部的IL-17A由CD4~+T细胞和巨噬细胞分泌。上述结果提示Th17和Th1细胞均参与动脉粥样硬化的发生，而且Th17细胞在动脉粥样硬化晚期发挥更重要的作用。2. Th17和Th1细胞随动脉粥样硬化的发生在外周免疫器官中的变化为了观察Th17和Th1细胞在外周免疫器官中的变化，我们采用流式细胞术的方法检测Th17（CD4~+IL-17A~+）细胞和Th1（CD4~+IFN-γ~+）细胞在脾脏中的比例，结果显示在小鼠8周时，即无动脉粥样硬化斑块形成的小鼠脾脏中，实验组和对照组Th17和Th1细胞无明显的差异，在斑块形成的早期，Th17和Th1细胞比例在ApoE-/-小鼠脾脏中较对照组小鼠明显升高；随着疾病的进展，Th17和Th1细胞在斑块形成的晚期进一步升高，此外在疾病晚期小鼠脾脏中还发现一群即能够分泌IL-17A，同时也分泌IFN-γ的CD4~+T细胞（CD4~+IL-17A~+IFN-γ~+）较对照组小鼠也明显升高。进一步统计学分析显示Th17、Th1和CD4~+IL-17A~+IFN-γ~+T细胞的变化与动脉粥样硬化斑块的大小均呈明显的正相关，而且与小鼠血清中总胆固醇（TCH）的水平也呈现明显的正相关，这就提示Th17和Th1细胞均可能参与动脉粥样硬化的发生。（二）Th17细胞及IL-17A对动脉粥样硬化斑块形成的影响为了证实Th17细胞及IL-17A在动脉粥样硬化发生中的作用，我们用小鼠中和性IL-17A抗体和外源性小鼠IL-17A分别干预ApoE-/-小鼠，微型超声和油红O染色结果显示抗IL-17A抗体能够明显抑制斑块的形成，而外源性小鼠IL-17A则明显促进动脉粥样硬化斑块的形成，免疫组织化学染色结果显示IL-17A干预组小鼠斑块局部巨噬细胞的比例与对照组小鼠无明显差异，而平滑肌细胞的比例较对照组小鼠明显增多。该结果从正反两个方面证实IL-17A能够促进动脉粥样硬化斑块的形成，而且有可能促进斑块向不稳定型斑块发展。二、IL-17A通过激活NF-κB和p38，ERK通路上调aP2诱导巨噬细胞内质网应激并继发细胞凋亡进而加速动脉粥样硬化的发生和发展（一）IL-17A通过诱导巨噬细胞内质网应激促进细胞凋亡1. IL-17A促进巨噬细胞凋亡大量巨噬细胞凋亡能够促进动脉粥样硬化发生发展，为了研究IL-17A促进动脉粥样硬化发生的机制，在体外巨噬细胞用IL-17A刺激后，Hoechst染色和Annexin V/PI染色结果显示，IL-17A刺激后，随浓度的增高和时间延长，巨噬细胞内凋亡小体明显增多。流式细胞术定量分析显示IL-17A能够明显促进巨噬细胞发生晚期凋亡。2. IL-17A诱导小鼠及人来源的巨噬细胞发生内质网应激内质网应激是动脉粥样硬化发生过程中促进巨噬细胞凋亡的重要原因之一，为了研究IL-17A促进巨噬细胞凋亡的机制，小鼠巨噬细胞系RAW264.7和腹腔巨噬细胞在体外用IL-17A刺激后，Western Blotting结果显示内质网应激标志分子p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表达明显升高，由此可见IL-17A能够诱导小鼠巨噬细胞发生内质网应激。为了观察IL-17A是否对人来源巨噬细胞也具有同样的作用，我们将单核细胞系Thp-1和人外周血单个核细胞（PBMC）体外诱导成巨噬细胞后，加入IL-17A刺激，Western Blotting结果显示p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表达同样明显升高。上述结果说明IL-17A在体外能够诱导人和小鼠来源的巨噬细胞发生内质网应激。3. IL-17A诱导动脉粥样硬化斑块局部巨噬细胞发生内质网应激为了验证是否在小鼠体内IL-17A也能诱导巨噬细胞发生内质网应激，我们首先用Western Blotting检测主动脉弓部p-PERK、p-eIF2α和XBP1s的表达，结果显示IL-17A干预组小鼠斑块局部内质网应激标志分子的表达均明显高于对照组小鼠。进一步我们采用免疫组织化学染色的方法定位检测斑块局部Moma-2，p-PERK和p-eIF2α的表达，结果显示在巨噬细胞表达部位，p-PERK和p-eIF2α的表达量占斑块面积的比例在IL-17A干预组小鼠明显高于对照组小鼠，该结果说明IL-17A不仅可以在体外，在斑块局部也能够诱导巨噬细胞发生内质网应激。4. IL-17A通过诱导巨噬细胞内质网应激促进细胞凋亡长期内质网应激能够导致细胞发生凋亡，内质网应激诱导细胞凋亡主要通过上调CHOP的表达、激活caspas12分子、激活JNK进而活化Bcl-2，最终通过活化caspase3诱导细胞发生凋亡。为了探索IL-17A是否通过诱导内质网应激促进巨噬细胞凋亡，我们首先在体外发现IL-17A能够促进CHOP和caspase3剪切体的表达，caspase12略有上调。为了在小鼠体内验证该结果，我们将ApoE-/-小鼠随机分为三组：对照组，IL-17A干预组，IL-17A联合PBA干预组。Western Blotting和免疫组化染色显示IL-17A干预组小鼠斑块局部CHOP表达明显上调，而caspase12无明显的差异，caspase3剪切体的表达亦明显升高；而IL-17A联合PBA干预组，p-PERK和p-eIF2α的表达较IL-17A干预组明显减弱，说明PBA能够缓解IL-17A诱导的巨噬细胞内质网应激，同时CHOP和caspase3的表达较IL-17A干预组亦明显减弱，caspase12无明显的差异。Tunnel染色结果显示IL-17A干预组小鼠斑块局部凋亡的巨噬细胞数量明显高于对照组小鼠，而IL-17A联合PBA干预组凋亡细胞则较IL-17A干预组明显减少。上述结果证实IL-17A通过诱导巨噬细胞内质网应激进而通过激活CHOP-caspase3通路促进巨噬细胞的凋亡。（二）IL-17A通过内质网应激引起的巨噬细胞凋亡促进动脉粥样硬化的发生ApoE-/-小鼠随机分为三组（对照组，IL-17A干预组，IL-17A联合PBA干预组）进行干预后，我们采用油红O染色的方法检测斑块的大小及脂质沉积，结果显示IL-17A干预组小鼠主动脉根部斑块的面积明显较对照组增大，而IL-17A联合PBA干预组小鼠的斑块面积则明显较IL-17A单独干预组减小，由此可见，IL-17A确实是通过诱导巨噬细胞内质网应激进而通过激活CHOP-caspase3通路促进细胞凋亡、加速动脉粥样硬化斑块的形成。（三）IL-17A通过激活NF-κB和p38，ERK通路上调aP2诱导巨噬细胞内质网应激的发生1. IL-17A上调aP2的表达诱导巨噬细胞内质网应激有研究表明aP2表达增高能够促进巨噬细胞内质网应激的发生，为了研究IL-17A诱导巨噬细胞内质网应激的发生机制，在体外我们用RT-PCR和WesternBlotting检测发现IL-17A能够在RNA和蛋白水平上调巨噬细胞内aP2的表达；此外在小鼠体内我们也发现IL-17A干预组小鼠斑块局部aP2的表达较对照组小鼠明显升高。为了证实IL-17A是通过上调aP2的表达诱导巨噬细胞内质网应激，在体外我们先用aP2抑制剂作用于巨噬细胞，然后再加入IL-17A刺激，WesternBlotting检测结果显示p-eIF2α和XBP1s的表达较IL-17A单独刺激明显减弱，该结果证实IL-17A通过上调aP2的表达诱导巨噬细胞内质网应激的发生。2. IL-17A激活NF-κB和p38、ERK通路上调aP2的表达IL-17A与其受体结合后能够通过激活NF-κB和MAPK通路传递信号入细胞，诱导多种分子的表达。为了研究IL-17A上调aP2的机制，IL-17A刺激巨噬细胞后，我们采用Western Blotting检测发现p-IκB和p-p38，p-ERK，p-JNK的表达均明显升高。进一步我们分别用NF-κB和p38，ERK，JNK抑制剂作用巨噬细胞，然后用IL-17A刺激后检测aP2的表达，结果显示NF-κB和p38，ERK抑制作用后aP2的水平明显减弱。由此可以证明IL-17A通过激活NF-κB和p38、ERK通路进而促进aP2的表达。结论1. Th17细胞及效应分子IL-17A具有促进动脉粥样硬化的作用动脉粥样斑块局部Th17细胞和IL-17A高表达，外周免疫器官中Th17细胞的数量随着动脉粥样硬化的发生和发展逐渐升高，并与动脉粥样硬化斑块的大小及总胆固醇的水平呈正相关，体内实验证实Th17细胞及效应分子IL-17A能够促进动脉粥样硬化斑块形成。2. IL-17A诱导巨噬细胞发生内质网应激和继发的细胞凋亡是IL-17A加速动脉粥样硬化斑块形成的机制之一IL-17A在体外以及斑块局部均能够诱导巨噬细胞发生内质网应激，长期内质网应激可以进一步通过激活CHOP-caspase3通路促进巨噬细胞凋亡，进而加速动脉粥样硬化斑块的形成。3. IL-17A诱导的aP2上调是其导致巨噬细胞发生内质网应激的机制之一IL-17A可通过激活NF-κB和p38、ERK通路上调脂肪酸结合蛋白aP2的表达，抑制剂阻断aP2的表达则明显抑制IL-17A诱导的巨噬细胞内质网应激。创新性和意义本研究通过体内外实验，系统研究了新的T细胞亚群Th17细胞及其主要效应分子IL-17A在动脉粥样硬化斑块形成中的作用及其机制，对揭示动脉粥样硬化的免疫机制、防治动脉粥样硬化相关的心血管疾病具有重要的理论价值和潜在的应用价值。本研究的主要创新点和意义如下：1.证明Th17和IL-17A参与促进动脉粥样硬化的发生和发展，外源性IL-17A治疗明显促进动脉粥样硬化斑块的形成，而中和性抗IL-17A抗体的应用可有效缓解斑块的发展，为临床以IL-17A为靶点治疗动脉粥样硬化提供了有力的理论和实验依据。2.在国内外首先发现IL-17A能诱导巨噬细胞发生内质网应激，长期内质网应激继发的细胞凋亡是IL-17A促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一，用化学伴侣分子PBA阻断内质网应激可有效控制IL-17A介导的动脉粥样硬化病变的进展。3.在国内外首先发现IL-17A可通过NF-κB和p38/ERK MAKP信号通路上调脂肪酸结合蛋白aP2，进而诱导内质网应激的发生；首次通过aP2将细胞因子和脂质代谢联系在一起，为研究炎症反应与脂质代谢疾病的相互关系及机制提供了新的思路。4.本研究证实IL-17A中和性抗体、内质网应激抑制剂PBA能够抑制斑块的形成，aP2抑制剂能够缓解巨噬细胞内质网应激，为临床以炎性因子、细胞内质网应激及脂质代谢为靶点联合治疗动脉粥样硬化提供了有力的理论和实验依据。研究的局限性1. IL-17A诱导内质网应激发生的机制还有待于更深入的研究；2. aP2影响IL-17A诱导的内质网应激和促进斑块作用的体内试验尚有待进一步的确定。