海水中铁载体的固相萃取预处理和色谱/质谱分析

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铁在生物的生命活动中扮演着重要角色,如含铁蛋白在生物的光合作用、呼吸作用、硝酸盐和亚硝酸盐的还原、氮的固定及DNA的合成等过程中都起着不可替代的作用。但是海洋表层的生物可利用态铁浓度极低,影响甚至限制着浮游植物的生长。在铁限制条件下,海洋中的一些细菌和真菌能够合成并分泌一种与铁有极强螯合能力的低分子量有机配体——铁载体。铁载体被释放到细胞外后有效地与铁结合,通过细胞膜上特定铁载体受体的识别和转运,将铁运输到微生物细胞内,以满足生物体对铁的需求。  由于铁载体结构复杂多样,在海洋环境中浓度低,分析相对困难。传统的前处理方法存在着操作繁琐、重现性较差等缺点;经典的铁载体测定方法易受基底干扰,回收率和灵敏度均较差。针对现有方法存在的不足,本研究建立了回收率较高、重现性好、检出限较低、定性准确、操作简单的海水中氧肟酸型铁载体的分析方法。主要内容和结果如下:  (1)建立了铁载体的高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)测定方法,考察了不同类型的色谱柱、流动相组成、梯度洗脱程序等参数,以标准物质的分离度、峰形及响应强度为标准,优化分离检测条件。结果显示,C18液相色谱柱对目标物的分离效果优于凝胶色谱柱。Pyoverdines-Fe(PVDs-Fe)在0.20-8.00μg/mL、Ferrichrome(FC)在3.00-20.00μg/mL、Ferrioxamine E(FO E)在0.20-5.00μg/mL范围内线性良好,仪器检出限为PVDs-Fe0.015μg/mL、FC0.155μg/mL、FO E0.061μg/mL,定量限为PVDs-Fe0.050μg/mL、FC0.517μg/mL、FOE0.203μg/mL。  (2)优化了海水中铁载体的固相萃取(SPE)预处理参数。分别以人工海水和天然海水为基质,建立了铁载体的SPE预处理方法。采用正交实验,考察了SPE柱型、洗脱溶剂种类和用量、样品pH、上样体积等因素对萃取效果的影响。选择的SPE条件为:ENVI-18为萃取柱,100%甲醇为洗脱溶剂,洗脱溶剂体积4mL,不调节盐度和pH,上样体积设为1.0L。以1.0 L近岸海水进行加标实验,得到三种目标物方法的平均萃取效率为PVDs-Fe39.6%,FC144%,FOE76.1%;相对标准偏差(RSD)(n=3)分别为12.1%、6.50%、7.70%。  (3)建立了海水中铁载体的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法。在HPLC-DAD方法的基础上,对HPLC-MS/MS分离条件进行优化,提高分析速度、灵敏度、定性准确性。三种铁载体化合物标准物质PVDs-Fe、FC、FO E的测定线性范围分别为0.001-3.00μg/mL、0.005-15.00μg/mL、0.001-3.00μg/mL,相关系数R2>0.99;仪器检出限分别为0.08 ng/mL、1.76 ng/mL和1.36ng/mL;定量限分别0.27 ng/mL、5.87 ng/mL和4.53 ng/mL。结合所建立的SPE前处理方法,进行方法回收率实验,三种目标物四次测定的RSDs<12%,方法回收率分别为PVDs-Fe12.1%-18.6%,FC82.0%-97.7%,FO E70.0%-98.3%。分析取自厦门近岸海域海水中的铁载体,未检出类铁载体物质。本研究尝试利用质谱图对铁载体目标物进行初步结构解析,为未知铁载体的结构分析提供基础。
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